Visualisering af Germinosomes og den indre membran i Bacillus subtilis sporer
Summary
Germinant receptor proteiner klynge i ‘germinosomes’ i den indre membran af Bacillus subtilis sporer. Vi beskriver en protokol bruger super opløsning mikroskopi og lysstofrør reporter proteiner til at visualisere germinosomes. Protokollen identificerer også spore indre membran domæner, der fortrinsvis farves med membran farvestof FM4-64.
Abstract
Den lille størrelse af sporer og den relativt lave overflod af spiring proteiner, forårsage vanskeligheder i deres mikroskopiske analyser ved hjælp af epifluorescensmikroskop mikroskopi. Super-opløsning tredimensional struktureret belysning mikroskopi (3D-SIM) er et lovende redskab til at overvinde denne forhindring og afsløre de molekylære detaljer af processen for spiring af Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer. Her, vi beskriver brugen af en modificeret SIMcheck (ImageJ)-assistent 3D billedprocessen og fluorescerende reporter proteiner til SIM-mikroskopi af B. subtilis sporer germinosomes, clusters af spiring proteiner. Vi præsenterer også en (standard) 3D-SIM imaging procedure for FM4-64 farvning af B. subtilis spore membraner. Ved hjælp af disse procedurer, vi opnåede uovertruffen opløsning for germinosome lokalisering og viser, at > 80% af B. subtilis KGB80 hvilende sporer fremstillet efter sporulering på definerede minimal MOPS medium har en eller to GerD-normal god landbrugspraksis og GerKB-mCherry Foci. Lyse foci blev også observeret i FM4-64 farves sporer 3D-SIM billeder tyder på, at indre membran lipid domæner af forskellige fluiditet sandsynligvis findes. Yderligere er undersøgelser, der bruger dobbelt mærkning procedurer med membran farvestoffer og germinosome reporter proteiner til at vurdere Co lokalisering og dermed få et optimalt overblik over organiseringen af Bacillus spiring proteiner i indre spore membran muligt.
Introduction
Sporerne af ordrerne, Bacillales og Clostridiales er metabolisk inaktive og usædvanlig modstandsdygtig over for barske dekontaminering regimer, men medmindre de spire, ikke kan forårsage skadelige virkninger i mennesker1. I næringsstof germinant udløste spiring af Bacillus subtilis (B. subtilis) sporer er hændelsen indledning germinant binding til germinant receptorer (GRs) placeret i den spore indre membran (IM). Efterfølgende, transduce GRs signaler til den SpoVA kanal protein også placeret i IM. Dette resulterer i fremkomsten af udveksling af spore core pyridin-2,6-dicarboxylsyrer syre (dipicolinic syre; DPA; bestående af 20% af spore core tør wt) for vand via SpoVA kanal. Efterfølgende, DPA release udløser aktivering af cortex peptidoglycan hydrolyse, og ekstra vand optagelse følger2,3,4. Disse begivenheder medfører mekanisk stress på coat lag, dets efterfølgende brud, udbrud af udvækst og endelig vegetativ vækst. Men de præcise molekylære detaljer af spireevne processen er stadig langt fra løst.
En større spørgsmål om sporespiring vedrører de biofysiske egenskaber af lipider omkring IM spiring proteiner samt IM SpoVA kanal proteiner. Denne stort set ubevægelige IM lipid tolagede er den vigtigste permeabilitet barriere for mange små molekyler, herunder giftige kemiske konserveringsmidler, hvoraf nogle øve deres aktion i spore core eller vegetativt cellen cytoplasma5,6. IM lipid tolagede forventes i en gel, selv om der er en betydelig brøkdel af mobile lipider i IM5. Spore’s IM har også potentiale for betydelig udvidelse5. Således er arealet af IM øger 1.6-fold efter spiring uden yderligere membran syntese og er ledsaget af tabet af denne membran karakteristiske lav permeabilitet og lipid immobilitet5,6.
Mens de Molekylær oplysninger om aktivering af spiring proteiner og organisation af IM lipider i sporer er attraktive emner til undersøgelse, udgør den lille størrelse af B. subtilis sporer og den relativt lave overflod af spiring proteiner, en udfordring mikroskopiske analyser. Griffiths et al. overbevisende epifluorescensmikroskop mikroskop beviser, tyder ved hjælp af fluorescerende reportere smeltet til spiring proteiner, på, at i B. subtilis sporer stillads protein GerD arrangerer tre GR underenheder (A, B og C) for GerA, B og K GRs, i en klynge7. De opfandt udtrykket ‘germinosome’ for denne klynge af spiring proteiner og beskrevet strukturerne som ~ 300 nm store IM protein foci8. Ved indledningen af sporespiring, fluorescerende germinosome foci i sidste ende ændre i større sprede fluorescerende mønstre, med > 75% af spore populationer vise dette mønster i sporer spirede i 1 time med L-valin8. Bemærk, at papiret nævnt ovenfor brugte i gennemsnit billeder fra snesevis af på hinanden følgende fluorescerende billeder, at få statistiske magt og overvinde forhindring af lav fluorescerende signaler observeret under imaging. Denne visualisering af disse strukturer i bakteriesporer var på kanten af hvad der er teknisk gennemførligt med klassisk mikroskopiske værktøjer og hverken en vurdering af mængden af foci i en enkelt spore var heller ikke deres mere detaljerede subcellulært lokalisering muligt med denne tilgang.
Her, demonstrere vi brugen af strukturerede belysning mikroskopi (SIM) at opnå en detaljeret visualisering og kvantificering af germinosome(s) i sporer af B. subtilissamt deres IM lipid domæner9. Protokollen indeholder også instruktioner til sporulering, dias forberedelse og billedanalyse af SIMcheck (v1.0, en imageJ plugin) samt ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteret indeholder en standard 3D-SIM procedure for analyse af FM4-64 farves B. subtilis sporer, der omfatter sporulering, dias forberedelse og imaging processer. Derudover protokollen beskriver en modificeret SIMcheck (ImageJ)-assisteret 3D imaging proces for SIM-mikroskopi af B. subtilis spore germinosomes mærket med fluorescerende journalister. Den sidstnævnte procedure tillod os at observere denne dim Underskabet med øget kontrast. Ved at koble to billeddiagnostiske procedurer, e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Christiaan Zeelenberg for hans hjælp under SIM-billeddannelse. JW erkender at Kina stipendium Rådet for et ph.d.-stipendium og tak Irene Stellingwerf for hendes hjælp i den primære fase af billedbehandling.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
