Visualisation de Germinosomes et de la Membrane interne dans les Spores de Bacillus subtilis
Summary
Amas de protéines récepteurs germinant dans « germinosomes » dans la membrane interne de spores de Bacillus subtilis . Les auteurs décrivent un protocole utilisant des protéines de super-résolution microscopie et fluorescentes de journaliste pour visualiser germinosomes. Le protocole précise également domaines de membrane interne de spores qui sont préférentiellement souillées avec le colorant de membrane FM4-64.
Abstract
La petite taille des spores et la relativement faible abondance des protéines de la germination, causer des difficultés dans leurs analyses microscopiques à l’aide de la microscopie à épifluorescence. Super-résolution microscopie de Illumination structurée en trois dimensions (3D-SIM) est un outil prometteur pour surmonter cet obstacle et de révéler les détails moléculaires du processus de la germination des spores de Bacillus subtilis (b. subtilis). Nous décrivons ici l’utilisation d’un SIMcheck modifié (ImageJ)-processus d’imagerie 3D assistant et protéines fluorescentes journaliste pour la microscopie SIM de germinosomes des spores de b. subtilis , grappes des protéines de la germination. Nous présentons également une procédure d’imagerie 3D (standard)-SIM pour FM4-64 la souillure des membranes de spores de b. subtilis . Grâce à ces procédures, nous avons obtenu une résolution inégalable pour la localisation de germinosome et montrent que > 80 % des KGB80 de b. subtilis spores dormantes obtenues après la sporulation sur milieu minimal défini de MOPS ont un ou deux GerD-GFP et GerKB-mCherry foyers. Foyers lumineux ont été également observés dans FM4-64 colorées des images 3D-SIM des spores suggérant qu’il existe des domaines de lipides de membrane interne de fluidité différente susceptible. D’autres études qui utilisent double étiquetage des procédures avec des colorants de la membrane et germinosome protéines de journaliste pour évaluer la co-localisation et ainsi obtenir un aperçu optimal de l’organisation des protéines de la germination de bacille dans la membrane interne de spores sont possible.
Introduction
Les spores de l’ordre des Bacillales et Clostridiales sont métaboliquement inactives et extraordinairement résistant à des régimes sévères de décontamination, mais à moins qu’elles germent, ne causent pas des effets délétères dans les humains1. En éléments nutritifs germinant déclenchée la germination des spores de Bacillus subtilis (b. subtilis), l’événement d’initiation est germinant liant aux récepteurs germinant (GRs) situé dans la membrane interne de la spore (IM). Par la suite, les GRs transmettre des signaux à la protéine de canal de SpoVA que se trouve également dans le IM. Cela se traduit par l’apparition de l’échange de spore noyau pyridine-2, 6-dicarboxylique (acide dipicolinique ; DPA ; composée de 20 % du poids sec de la spore core) pour l’eau via le canal de SpoVA. Par la suite, la libération DPA déclenche l’activation de l’hydrolyse du peptidoglycane cortex et l’absorption d’eau supplémentaire suit2,3,4. Ces événements conduisent à un stress mécanique sur les couches du manteau, sa rupture ultérieure, l’apparition de l’excroissance et, enfin, la croissance végétative. Toutefois, les détails moléculaires exacts de la germination sont encore loin d’être résolues.
Une question majeure pour la germination des spores concerne les propriétés biophysiques des lipides qui entourent les protéines de germination IM ainsi que les protéines de canal IM SpoVA. Cette couche lipidique en grande partie immobile IM est la barrière de perméabilité principal pour beaucoup de petites molécules, y compris des conservateurs chimiques toxiques, dont certains exercent leur action dans la base de spores ou de la cellule végétative cytoplasme5,6. La bicouche lipidique IM est probablement dans un état de gel, mais il y a une fraction importante des lipides mobiles dans l’IM5. IM de la spore a également le potentiel d’expansion considérable5. Ainsi, la superficie de la messagerie instantanée augmente de 1,6 fois à la germination sans synthèse membranaire supplémentaires et s’accompagne de la perte de cette membrane caractéristique faible perméabilité et lipides immobilité5,6.
Alors que les détails moléculaires de l’activation des protéines de la germination et organisation des lipides IM dans les spores sont des sujets attrayants pour l’étude, la petite taille des spores de b. subtilis et la relativement faible abondance des protéines de la germination, posent un défi analyses microscopiques. Griffiths et al une épifluorescence microscope preuve concluante, à l’aide de reporters fluorescents fusionnés aux protéines de la germination, donne à penser que dans les spores de b. subtilis , la protéine d’échafaudage GerD organise trois sous-unités GR (A, B et C) de GerA, B et K GRs, dans un cluster7. Ils a inventé le terme « germinosome » pour ce cluster des protéines de la germination et les structures qualifiées de ~ 300 nm grand IM protéine foyers8. Au début de la germination des spores, fluorescent germinosome foyers en fin de compte transforment en plus disperser modèles fluorescents, avec > 75 % des populations de spores affichant ce modèle dans les spores germent pendant 1 h avec la L-valine,8. Notez que le document mentionné ci-dessus utilisés en moyenne des images depuis des dizaines d’images fluorescentes consécutives, pour gagner la puissance statistique et surmonter l’obstacle des faibles signaux fluorescents observées en imagerie. Cette visualisation de ces structures dans les spores bactériennes était au bord de ce qui est techniquement faisable avec les outils classiques de microscopiques et ni une évaluation du montant des foyers dans une seule spore ni leur localisation subcellulaire plus détaillée possible avec cette approche.
Ici, nous montrons l’utilisation de microscopie de Illumination structurée (SIM) pour obtenir une visualisation détaillée et la quantification de le germinosome(s) dans les spores de b. subtilis, ainsi que de leurs IM lipides domaines9. Le protocole contient également des instructions pour la sporulation, la préparation et l’analyse d’image par SIMcheck (v1.0, un plugin d’imageJ) ainsi que de ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté contient une procédure standard 3D-SIM pour l’analyse de FM4-64 teinté de spores de b. subtilis qui inclut la sporulation, préparation et processus d’imagerie. En outre, le protocole décrit une mis à jour le SIMcheck (ImageJ)-assistée des processus pour la microscopie SIM de b. subtilis spore germinosomes marqués avec des journalistes fluorescents d’imagerie 3D. Cette dernière procédure nous a permis d’observer cette sous-structure dim avec un contraste amélior?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Christiaan Zeelenberg pour son aide durant l’imagerie SIM. JW reconnaît le China Scholarship Council pour une bourse de doctorat et remercie Irene Stellingwerf pour son aide pendant la phase principale de l’imagerie.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
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