बसिलस सबटिल् स बीजाणु में अंकुरोसोम और भीतरी झिल्ली का दृश्यावलोकन
Summary
अंकुंट रिसेप्टर प्रोटीन बैसिलस सबटिल्स बीजाणु की भीतरी झिल्ली में ‘ अंकुरोसोम ‘ में क्लस्टर । हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन का उपयोग करने के लिए अंकुरित ओसोम कल्पना । प्रोटोकॉल भी बीजाणु भीतरी झिल्ली डोमेन है कि बेहतर झिल्ली डाई FM4-64 के साथ दाग रहे है पहचानता है ।
Abstract
बीजाणु के छोटे आकार और अंकुरण प्रोटीन के अपेक्षाकृत कम बहुतायत, एपिफ्लोरेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अपने सूक्ष्म विश्लेषण में कठिनाइयों का कारण । सुपर संकल्प त्रि-आयामी संरचित प्रदीप्ति माइक्रोस्कोपी (3D SIM) इस बाधा को दूर करने के लिए एक आशाजनक उपकरण है और बैसिलस सबटिल्स (बी. सबटिल्स) बीजाणु के अंकुरण की प्रक्रिया के आणविक विवरणों को प्रकट करता है । यहाँ, हम एक संशोधित सिमचेक (ImageJ) के उपयोग का वर्णन-सहायक 3 डी इमेजिंग प्रक्रिया और बी के सिम माइक्रोस्कोपी के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटींस ‘ सबटिल्स ‘ बीजाणु अंकुरण, क्लस्टर (s) अंकुशन प्रोटीन के. हम भी एक (मानक) 3 डी-सिम इमेजिंग प्रक्रिया FM4-64 के धुंधला के लिए बी सबटिल्ज बीजाणु झिल्ली । इन प्रक्रियाओं का उपयोग करके, हम अंकुरासन स्थानीयकरण के लिए नायाब संकल्प प्राप्त किया और पता चलता है कि बी सबटिलिस KGB80 निष्क्रिय बीजाणु परिभाषित ंयूनतम mops माध्यम पर बीजाणु के बाद प्राप्त की > 80% एक या दो gerd-gfp और gerd-mops है Foci. उज्ज्वल फोकी भी FM4 में मनाया गया-64 दाग ‘ spores 3 डी-सिम छवियां सुझाव है कि विभिंन तरलता की भीतरी झिल्ली लिपिड डोमेन की संभावना मौजूद हैं । इसके अलावा अध्ययन है कि झिल्ली रंजक और अंकुरण रिपोर्टर प्रोटीन के साथ दोहरी लेबलिंग प्रक्रियाओं का उपयोग सह स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए और इस तरह के भीतरी बीजाणु झिल्ली में Bacillus अंकुरित प्रोटीन के संगठन का एक इष्टतम सिंहावलोकन हो रहे है संभव.
Introduction
आदेश के बीजाणु बेसिलेस और क्लोस्ट्रिडिएलीज़ metabolically निष्क्रिय और असाधारण कठोर विसंदूषण सरकारों के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, लेकिन जब तक वे अंकुरित, मानव में हानिकारक प्रभाव पैदा नहीं कर सकता1। पोषक तत्वों के अंकुरण में बेसिलस सबटिल्स (बी. सबटिल्स) बीजाणु का उगने से उत्पन्न होना, शुरूआती घटना बीजाणु की भीतरी झिल्ली (आईएम) में स्थित अंकुंत रिसेप्टर्स (जीआरएस) के लिए बाध्यकारी है । बाद में, GRs SpoVA चैनल प्रोटीन भी IM में स्थित करने के लिए संकेतों का पता लगाने । बीजाणु कोर पिरिडीन-2, 6-dicarboxylic एसिड के आदान प्रदान की शुरुआत में यह परिणाम (dipicolinic एसिड; DPA SpoVA चैनल के माध्यम से पानी के लिए बीजाणु कोर सूखी wt के 20% शामिल है) । बाद में, dpa जारी प्रांतस्था पेप्टिडोग्लाइकन hydrolysis के सक्रियण चलाता है, और अतिरिक्त पानी ऊपर उठाना2,3,4निंनानुसार है । इन घटनाओं कोट परतों पर यांत्रिक तनाव के लिए नेतृत्व, इसके बाद टूटना, बहिर्विकास की शुरुआत और, अंत में, वनस्पति विकास । हालांकि, अंकुरण प्रक्रिया के सटीक आणविक विवरण अभी भी हल से दूर हैं ।
बीजाणु अंकुरण के बारे में एक प्रमुख प्रश्न आईएम अंकुरण प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आईएम SpoVA चैनल प्रोटीन आसपास लिपिड के जैव भौतिक गुणों से संबंधित है । यह काफी हद तक स्थिर IM लिपिड bilayer कई छोटे अणुओं के लिए मुख्य पारगम्यता बाधा है, विषाक्त रासायनिक परिरक्षकों सहित, जिनमें से कुछ बीजाणु कोर या वनस्पति कोशिका कोशिका द्रव्य5,6में अपनी कार्रवाई डालती । Im लिपिड bilayer एक जेल राज्य में होने की संभावना है, हालांकि वहां im5में मोबाइल रक्तदाब का एक महत्वपूर्ण अंश है । बीजाणु IM भी महत्वपूर्ण विस्तार5के लिए क्षमता है । इस प्रकार, आईएम की सतह क्षेत्र अतिरिक्त झिल्ली संश्लेषण के बिना अंकुरण पर १.६-गुना बढ़ जाती है और इस झिल्ली की विशेषता कम पारगम्यता और लिपिड गतिहीनता5,6की हानि के साथ है ।
जबकि अंकुरण प्रोटीन के सक्रियण के आणविक विवरण और आईएम लिपिड के संगठन बीजाणु में अध्ययन के लिए आकर्षक विषय हैं, बी सबटिलिस बीजाणु के छोटे आकार और अंकुरण प्रोटीन के अपेक्षाकृत कम बहुतायत, एक चुनौती पैदा सूक्ष्मदर्शी विश्लेषण के लिए । ग्रिफिथ एट अल. संमोहक epifluorescence माइक्रोस्कोप सबूत, प्रतिदीप्त पत्रकारों का उपयोग अंकुरण प्रोटीन के लिए संगलित, पता चलता है कि बी सबटिलिस बीजाणु पाड़ प्रोटीन गर्ड में तीन जीआर subयूनिट्स (ए, बी और सी) के लिए गेरा, बी और कश्मीर grs का आयोजन करता है, एक क्लस्टर में7। वे अंकुरण प्रोटीन के इस समूह के लिए ‘ अंकुरित ‘ शब्द गढ़ा और संरचनाओं के रूप में वर्णित ~ ३०० एनएम बड़े IM प्रोटीन फोकी8। बीजाणु अंकुरण की शुरूआत करने पर, फ्लोरोसेंट अंकुरित फोक अंततः बड़े फैलाव फ्लोरोसेंट पैटर्न में बदल जाता है, > के साथ 75% बीजाणु आबादी के इस पैटर्न को प्रदर्शित करता है जिसके साथ 1 ज से एल-वैलाइन8के लिए अंकुरित होता है । ध्यान दें कि ऊपर उल्लेख कागज लगातार फ्लोरोसेंट चित्रों के दर्जनों से औसत छवियों का इस्तेमाल किया, सांख्यिकीय शक्ति हासिल है और कम फ्लोरोसेंट संकेतों की बाधा को दूर इमेजिंग के दौरान मनाया । बैक्टीरियल बीजाणु में इन संरचनाओं के इस दृश्य क्या शास्त्रीय सूक्ष्म उपकरणों के साथ तकनीकी रूप से संभव है और न ही एक बीजाणु में फोकी की राशि का मूल्यांकन और न ही उनके अधिक विस्तृत subcellular स्थानीयकरण के किनारे पर था इस दृष्टिकोण के साथ संभव है ।
यहां, हम संरचित प्रदीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम) के उपयोग के लिए एक विस्तृत दृश्य प्राप्त करने के लिए और अंकुरों की मात्रा (एस) के बीजाणु में बी सबटिल्स, के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनके आईएम लिपिड डोमेन9का प्रदर्शन । प्रोटोकाल में स्मस्युलेशन, स्लाइड तैयारी और इमेज एनालिसिस के साथ सिमचेक (v 1.0, एक इमेजेज प्लगइन) के साथ-साथ इमेजेज10,11,12के लिए भी निर्देश हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एक मानक 3D-SIM प्रक्रिया है जिसमें FM4-64 सना बी सबटिल्स बीजाणु होते हैं, जिनमें स्पो्यूलेशन, स्लाइड तैयारी और इमेजिंग प्रक्रियाएं शामिल हैं । इसके अलावा, प्रोटोकॉल एक संशोधित सिमच…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक सिम इमेजिंग के दौरान उनकी सहायता के लिए Christiaan Zeelenberg धंयवाद । JW एक पीएचडी फैलोशिप के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद और धंयवाद इमेजिंग के प्राथमिक स्तर के दौरान उसकी मदद के लिए Irene Stellingwerf स्वीकार करता है ।
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
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