Cluster di proteine recettoriali germinant in ‘germinosomes’ nella membrana interna di spore di Bacillus subtilis . Descriviamo un protocollo utilizzando super risoluzione di microscopia e fluorescenti di proteine reporter per visualizzare germinosomes. Il protocollo identifica anche domini di membrana interna di spore che sono preferenzialmente colorate con il colorante di membrana FM4-64.
Le piccole dimensioni delle spore e la relativamente bassa abbondanza di proteine di germinazione, causare difficoltà nelle loro analisi microscopiche mediante epifluorescenza. Microscopia di Super-risoluzione tridimensionale strutturato illuminazione (3D-SIM) è uno strumento promettente per superare questo ostacolo e rivelare i dettagli molecolari del processo di germinazione delle spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis). Qui, descriviamo l’uso di un SIMcheck modificato (ImageJ)-processo di imaging 3D assistente e proteine reporter fluorescenti per microscopia SIM di germinosomes di b. subtilis spore, interumana delle proteine di germinazione. Presentiamo anche una procedura di imaging 3D-SIM (standard) per la colorazione delle membrane di spore di Bacillus subtilis FM4-64. Utilizzando queste procedure, abbiamo ottenuto la risoluzione insuperabile per la localizzazione di germinosome e mostrano che > 80% dei KGB80 di b. subtilis spore dormienti ottenute dopo la sporulazione su medium MOPS minimo definito hanno uno o due GerD-GFP e GerKB-mCherry fuochi. I fuochi luminosi erano anche osservato in FM4-64 macchiati immagini 3D-SIM spore suggerendo che domini lipidici della membrana interna di differenti fluidità probabile che esistano. Ulteriori studi che utilizzano la doppia etichettatura procedure con membrana coloranti e germinosome proteine reporter per valutare co-localizzazione e quindi ottenere una panoramica ottimale dell’organizzazione delle proteine di germinazione del bacillo nella membrana interna spora sono possibile.
Spore degli ordini Bacillales e Clostridiales sono metabolicamente dormienti e straordinariamente resistente ai regimi di decontaminazione duro, ma a meno che non germinano, non possono causare effetti deleteri in esseri umani1. In nutrienti germinant innescata germinazione di spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), l’evento di iniziazione è germinant legame ai recettori germinant (GRs) situato nella membrana interna di spore (IM). Successivamente, il GRs trasdurre segnali alla proteina canale SpoVA anche situato nel IM. Questo provoca l’inizio dello scambio di spora core piridina-2,6-dicarbossilico (acido dipicolinico; DPA; composto da 20% di spora core asciutto wt) per l’acqua tramite il canale di SpoVA. Successivamente, il rilascio DPA innesca l’attivazione di idrolisi di peptidoglicano di corteccia, e l’assorbimento di acqua supplementare segue2,3,4. Questi eventi conducono allo sforzo meccanico degli strati di cappotto, sua rottura successiva, l’insorgenza di conseguenza e, infine, lo sviluppo vegetativo. Tuttavia, lungi dal vengono risolti i dettagli molecolari del processo di germinazione.
Una domanda importante sulla germinazione delle spore riguarda le proprietà biofisiche dei lipidi che circonda le proteine di germinazione di IM come pure le proteine canale IM SpoVA. Questo doppio strato lipidico in gran parte immobile IM è la barriera di permeabilità principale per molte piccole molecole, tra cui conservanti chimici tossici, alcuni dei quali esercitano la loro azione nel nucleo di spora o cellula vegetativa citoplasma5,6. Il doppio strato lipidico IM è probabilmente in uno stato di gel, anche se c’è una frazione significativa dei lipidi mobile in IM5. IM della spora ha anche il potenziale per un’espansione significativa5. Quindi, l’area della superficie dell’IM aumenta 1.6-fold su germinazione senza sintesi ulteriori della membrana ed è accompagnata dalla perdita di questa membrana caratteristica bassa permeabilità e lipidica immobilità5,6.
Mentre i dettagli molecolari dell’organizzazione dei lipidi IM in spore e l’attivazione delle proteine di germinazione sono argomenti interessanti per lo studio, la piccola dimensione delle spore di Bacillus subtilis e l’abbondanza relativamente basso di proteine di germinazione, rappresentano una sfida per analisi al microscopio. Griffiths et al epifluorescenza microscopio prova coercitiva, utilizzando reporter fluorescenti fuso a proteine di germinazione, suggerisce che nel b. subtilis spore la proteina dell’impalcatura GerD organizza tre subunità GR (A, B e C) di GerA, B e K GRs, in un cluster7. Hanno coniato il termine ‘germinosome’ per questo cluster di proteine di germinazione e descritto le strutture come ~ 300 nm grande IM proteina fuochi8. All’inizio della germinazione delle spore, fluorescente germinosome i fuochi alla fine trasformarsi in grandi disperdere modelli fluorescente, con > 75% delle popolazioni di spora visualizzano questo modello in spore germinati per 1 h con L-valina8. Si noti che il libro citato sopra usate media immagini da decine di immagini consecutive fluorescente, per guadagnare potere statistico e superare l’ostacolo dei segnali fluorescenti Bassi osservato durante la formazione immagine. Questa visualizzazione di queste strutture in spore batteriche era ai margini di ciò che è tecnicamente fattibile con strumenti microscopici classici e né una valutazione della quantità di fuochi in una singola spora né era loro localizzazione subcellulare più dettagliate possibile con questo approccio.
Qui, dimostriamo che l’uso della microscopia di illuminazione strutturata (SIM) per ottenere una visualizzazione dettagliata e quantificazione di germinosome(s) le spore di Bacillus subtilis, nonché dei loro domini lipidici IM9. Il protocollo contiene anche le istruzioni per la sporulazione, la preparazione del vetrino e l’analisi di immagine di SIMcheck (v 1.0, un plugin di imageJ) così come ImageJ10,11,12.
Il protocollo presentato contiene una procedura di 3D-SIM standard per l’analisi di FM4-64 macchiato di spore di Bacillus subtilis che include la sporulazione, preparazione del vetrino e processi di imaging. Inoltre, il protocollo descrive un SIMcheck modificato (ImageJ)-assistita processo per microscopia SIM di germinosomes di spore di Bacillus subtilis etichettati con reporter fluorescenti di imaging 3D. La procedura di quest’ultima ci ha permesso di osservare questa sottostruttura dim con maggiore co…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Christiaan Zeelenberg per la sua assistenza durante l’imaging di SIM. JW riconosce il Consiglio di borsa di studio di Cina per una borsa di dottorato e grazie Irene Stellingwerf per il suo aiuto durante la fase primaria di imaging.
Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
Image J | |||
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
Nikon Eclipse Ti microscope | |||
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |