Visualización de Germinosomes y la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis
Summary
Grupo de proteínas de receptor germinant en ‘germinosomes’ en la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis . Se describe un protocolo utilizando proteínas de super resolución microscopia y fluorescente reportera para visualizar germinosomes. El protocolo también identifica dominios de membrana interna de la espora que preferentemente se tiñen con el colorante de membrana FM4-64.
Abstract
El pequeño tamaño de las esporas y la relativamente baja abundancia de proteínas de la germinación, causar dificultades en sus análisis microscópicos mediante microscopía de epifluorescencia. Microscopía de iluminación estructurada tridimensional súper resolución (3D-SIM) es una herramienta prometedora para superar este obstáculo y revelar los detalles moleculares del proceso de germinación de las esporas de Bacillus subtilis (B. subtilis). Aquí, describimos el uso de un SIMcheck modificado (ImageJ)-proceso de proyección de imagen 3D asistente y reportero fluorescente proteínas para microscopía SIM de germinosomes de esporas B. subtilis , clusters de las proteínas de la germinación. También presentamos un procedimiento de proyección de imagen 3D-SIM (estándar) para FM4-64 tinción de membranas de esporas B. subtilis . Mediante el uso de estos procedimientos, obtuvo una resolución para la localización de germinosome y demostrar que > 80% de B. subtilis KGB80 esporas latentes obtenidas después de la esporulación en el medio mínimo definido de MOPS tienen uno o dos GerD-GFP y GerKB-mCherry focos. Focos brillantes fueron también observados en FM4-64 manchados imágenes de 3D-SIM de esporas sugiriendo que existen dominios de lípidos de membrana interna probablemente diferentes fluidez. Otros estudios que utilizan doble etiquetado procedimientos con tintes de membrana y germinosome proteínas de reportero para evaluar la localización y así obtener un panorama óptimo de la organización de proteínas de bacilo germinación en la membrana interna de la espora son posible.
Introduction
Esporas de orden Bacillales y Clostridiales son metabólicamente inactivos y extraordinariamente resistente a los regímenes de descontaminación áspero, pero a menos que germinan, no pueden causar efectos nocivos en los seres humanos1. En la germinación activada germinant nutrientes de esporas de Bacillus subtilis (B. subtilis), el evento de iniciación es germinant Unión a los receptores germinant (GRs) situado en la membrana interna de la espora (IM). Posteriormente, el GRs transducen señales a la proteína de canal de SpoVA en el IM. Esto se traduce en el inicio del intercambio de esporas núcleo piridina-2, 6-dicarboxílico (ácido dipicolinic; DPA; comprende el 20% del peso seco de la base de espora) de agua a través del canal de SpoVA. Posteriormente, el lanzamiento DPA desencadena la activación de la hidrólisis del peptidoglicano de la corteza, y absorción de agua sigue2,3,4. Estos eventos conducen a esfuerzos mecánicos en las capas de la capa, su posterior ruptura, la aparición de la consecuencia y, finalmente, crecimiento vegetativo. Sin embargo, todavía lejos de se resuelven los detalles moleculares exactos del proceso de germinación.
Una cuestión importante sobre la germinación de esporas refiere a las propiedades biofísicas de los lípidos que rodean las proteínas de germinación IM así como las proteínas de canal de IM SpoVA. Esta bicapa de lipídica en gran parte inmóvil de IM es la barrera principal de la permeabilidad de muchas moléculas pequeñas, incluyendo conservantes químicos tóxicos, algunas de las cuales ejercen su acción en el núcleo de la espora o célula vegetativa citoplasma5,6. La bicapa lipídica IM es probable que en un estado de gel, aunque existe una fracción significativa de lípidos móviles en IM5. IM de la espora también tiene el potencial para una expansión significativa5. Así, aumenta la superficie de la IM 1.6-fold sobre germinación sin síntesis de membrana adicional y se acompaña de la pérdida de la membrana característica baja permeabilidad y lípidos inmovilidad5,6.
Mientras que los detalles moleculares de la activación de las proteínas de la germinación y organización de los lípidos de la IM en las esporas son atractivos temas de estudio, el pequeño tamaño de las esporas B. subtilis y la relativamente baja abundancia de proteínas de la germinación, plantean un desafío análisis microscópico. Griffiths et al. convincente evidencia de microscopio de epifluorescencia, utilizando reporteros fluorescentes fusionados a proteínas de la germinación, sugiere que en las esporas B. subtilis la proteína GerD organiza tres subunidades GR (A, B y C) de GerA, B y K GRs, en un cluster de7. Acuñó el término ‘germinosome’ para este grupo de proteínas de germinación y describe las estructuras como ~ 300 nm gran IM proteína focos8. Sobre la iniciación de la germinación de la espora, germinosome fluorescente focos en última instancia, cambian en mayor dispersar patrones fluorescentes, con > 75% de la población de esporas viendo este patrón en las esporas germinadas durante 1 h con L-valina8. Tenga en cuenta que el documento mencionado anteriormente usado promedio imágenes de docenas de imágenes fluorescentes consecutivos, para ganar potencia estadística y superar el obstáculo de baja señales fluorescentes observadas durante la proyección de imagen. Esta visualización de estas estructuras en esporas bacterianas estaba en el borde de lo que es técnicamente factible con herramientas microscópicas clásicas y ni una evaluación de la cantidad de focos en una sola espora ni su localización subcelular más detallada fue posible con este enfoque.
Aquí, demostramos que el uso de microscopía de iluminación estructurada (SIM) para obtener una visualización detallada y cuantificación de la germinosome(s) de las esporas de B. subtilis, así como de sus IM lípidos dominios9. El protocolo también contiene instrucciones para la esporulación, preparación de los portaobjetos y análisis de imagen por SIMcheck (v1.0, un plugin de imageJ) así como ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado contiene un procedimiento estándar 3D-SIM para el análisis de FM4-64 tinción de esporas B. subtilis que incluye esporulación, preparación de los portaobjetos y procesos de la proyección de imagen. Además, el protocolo describe un SIMcheck modificado (ImageJ)-asistido 3D imaging proceso para microscopía SIM de germinosomes de esporas B. subtilis con reporteros fluorescentes. El último procedimiento nos ha permitido observar esta estructura tenue con contraste. Por acoplam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Christiaan Zeelenberg por su ayuda durante la proyección de imagen de la SIM. JW reconoce al Consejo de becas de China para una beca predoctoral y gracias Irene Stellingwerf por su ayuda durante la etapa primaria de la proyección de imagen.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
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