Direkte Messung des KDM1A Target Engagements mit Chemoprobe-basierten Immunoassays
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung des KDM1A-Zielengagements in einer menschlichen oder tierischen Zelle, Gewebe oder Blutproben vor, die mit KDM1A-Hemmern behandelt werden. Das Protokoll verwendet Chemoprobe-Tagging des freien KDM1A-Enzyms und direkte Quantifizierung des Zielbegebungsmittels mittels chemoprobebasierter Immunoassays und kann in präklinischen und klinischen Studien eingesetzt werden.
Abstract
Die Bewertung des Zielengagements, definiert als die Wechselwirkung eines Arzneimittels mit dem Protein, für das es entwickelt wurde, ist eine Grundvoraussetzung für die Interpretation der biologischen Aktivität jeder Verbindung in der Arzneimittelentwicklung oder in Grundlagenforschungsprojekten. In der Epigenetik wird das Zielengagement am häufigsten durch die Analyse von Proxy-Markern bewertet, anstatt die Vereinigung der Verbindung zum Ziel zu messen. Zu den nachgelagerten biologischen Auslesungen, die analysiert wurden, gehören die Histonmarkmodulation oder Genexpressionsänderungen. KDM1A ist eine Lysindemethylase, die Methylgruppen aus mono- und dimethyliertem H3K4 entfernt, eine Modifikation, die mit dem Silencing der Genexpression verbunden ist. Die Modulation der Proxy-Marker hängt vom Zelltyp und der Funktion der genetischen Ausgestaltung der untersuchten Zellen ab, was die Interpretation und den Cross-Case-Vergleich recht schwierig machen kann. Um diese Probleme zu umgehen, wird ein vielseitiges Protokoll vorgestellt, um die Dosiseffekte und die Dynamik des direkten KDM1A-Zielengagements zu bewerten. Der beschriebene Test nutzt eine KDM1A-Chemoprobe, um hemmungsloses Enzym zu erfassen und zu quantifizieren, kann ohne genetische Veränderung breit auf Zellen oder Gewebeproben angewendet werden, verfügt über ein ausgezeichnetes Nachweisfenster und kann sowohl für die Grundlagenforschung verwendet werden. und Analyse klinischer Proben.
Introduction
Lysin-spezifische demethylase 1 (KDM1A)1 ist eine Demethylase, die an der Kontrolle der Gentranskription beteiligt ist. Dieses Protein hat sich als Kandidat pharmakologisches Ziel2 in der Onkologie herauskristallisiert; einschließlich Akute myeloische Leukämie3 (AML), Myelodysplasie-Syndrom (MDS)4, Myelofibrose (MF)5,6, Kleinzelllungenkrebs (SCLC)7; bei Sichelzellerkrankungen (SCD)8,9, und bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems einschließlich Alzheimer (AD), Multiple Sklerose (MS); und in Aggression10.
Die meisten KDM1A-hemmenden Verbindungen in der klinischen Entwicklung sind Cyclopropylamin-Derivate und hemmen das Protein durch kovalente Bindung an seinen Flavin-Adenin-Dinukleotid(FAD)-Kofaktor11. Die Hemmung von KDM1A induziert Veränderungen der Genexpression, aber diese Veränderungen variieren enorm zwischen Geweben, Zelltypen oder Krankheitsfällen. Hemmung von KDM1A ändert auch Histonzeichen12, aber diese Veränderungen werden in der Regel lokal an einer bestimmten Stelle im Genom produziert, und sind wieder, hoch Gewebe und zellspezifisch.
Das Protokoll wurde entwickelt, um das KDM1A-Zielengagement in biologischen Proben direkt zu messen und wurde für die Verwendung mit Cyclopropylamin-abgeleiteten Inhibitoren optimiert. Der Test basiert auf der ELISA-Technologie und analysiert parallel, Total und Free (d.h. ungebunden durch Inhibitor) KDM1A in einem nativen Proteinextrakt aus einer biologischen Probe in einem Solid-Phase-Assay. In einem ersten Schritt wird die biologische Probe in Gegenwart der biotinylierten KDM1A-selektiven Chemoprobe OG-88113,14, abgeleitet aus dem selektiven KDM1A-Inhibitor ORY-1001 (Iadademstat), einem potenten Inhibitor von KDM1A Entwicklung zur Behandlung onkologischer Erkrankungen. Die Chemoprobe hat einen IC50 für KDM1A von 120 nM und enthält eine FAD-Bindungsart, die mit einem biotinylierten Polyethylenglykol (PEG)-Schwanz verbunden ist. Die Chemoprobe bindet ausschließlich an die freie KDM1A, nicht aber an den inhibitorgebundenen KDM1A in der Probe. Nach der Chemoprobebindung werden die KDM1A, die Komplexe in der Probe enthält, auf Mikrotiterplatten mit Streptavidin-beschichteter Oberfläche erfasst, um freie KDM1A zu bestimmen, oder auf Platten, die mit einem monoklonalen Anti-KDM1A-Capture-Antikörper beschichtet sind, um die Gesamt-KDM1A zu bestimmen. Nach dem Waschen werden beide Platten mit einem Anti-KDM1A-Detektionsantikörper inkubiert, erneut gewaschen und mit einem sekundären HRP-konjugierten Esel-Antikaninchen-IgG-Antikörper zur Detektion mit einem lumineszierenden Substrat und zur Quantifizierung durch Messung relativer Lichteinheiten (RLU) in einem Luminometer (Abbildung 1).
Abbildung 1. Schema des ELISA-Enzyms verknüpftchemontierten Immunabsorptions-Assays für KDM1A-Zielengagement: A) Bestimmung der Gesamt-KDM1A mit Sandwich-ELISA und B) Bestimmung des freien KDM1A mit Chemoprobe ELISA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In beiden ELISA-Platten ist eine Standardkurve enthalten, um die Linearität jedes Assays zu überprüfen. Die Bestimmung des KDM1A-Zielengagements in jeder Probe wird dann als relativer Wert zur Vordosis- oder Fahrzeugprobe berechnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll wurde entwickelt, um das KDM1A-Zielengagement direkt mit einem neuartigen KDM1A Chemoprobe Capture-basierten ELISA zu messen. Die Methode wurde an kultivierten menschlichen Zelllinien und Ex-vivo-Proben von Mensch, Ratte und Maus und Pavian (einschließlich PBMCs, Lunge, Gehirn, Haut, Tumoren) validiert, kann aber leicht auf andere Arten angewendet werden, bei denen die KDM1A-Antikörper Epitope und katalytische Mitte konserviert werden. Da OG-881 eine aktivitätsbasierte Chemoprobe ist, i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von Oryzon Genomics finanziert. S.A., Hoffman-La Roche, teilweise unterstützt durch das CIIP-20152001 und RETOS Kollaborationsprogramm RTC-2015-3332-1.
Materials
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
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