Inducerbar, celle Type-specifikke udtryk i Arabidopsis thaliana gennem LhGR-medieret Trans-aktivering
Summary
Her, vi beskrive generation og anvendelsen af et sæt af gensplejsede Arabidopsis thaliana linjer aktivering inducerbar, væv-specifikke udtryk i de tre vigtigste ildens, skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium.
Abstract
Inducerbar, væv-specifikke udtryk er et væsentligt og stærkt værktøj til at studere genetiske undertrykkelse af netbårne spatio-temporale dynamik. Kombinerer den fleksible og effektive GreenGate kloning system med den gennemprøvede og benchmarkes LhGR system (her kaldt GR-LhG4) for inducerbar udtryk, har vi genereret et sæt gensplejsede Arabidopsis linjer, der kan drive et udtryk for en effektor kassette i et udvalg af specifikke celletyper i de tre største plante ildens. Med henblik herpå valgte vi den tidligere udviklet GR-LhG4 system baseret på en kimære transskription faktor og en beslægtet pOp-type promoter stram kontrol over en bred vifte af udtryk niveauer. Derudover for at visualisere domænet udtryk hvor de syntetiske transkriptionsfaktor er aktiv, er en ER-lokaliseret mTurquoise2 fluorescerende reporter under for pOp4 eller pOp6 kontrol kodet i driver linjer. Her beskriver vi de nødvendige skridt til at generere en driver eller effektor linje og demonstrere hvordan celle type specifikke udtryk kan induceret og fulgt i skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium i Arabidopsis. Ved hjælp af flere eller alle driver linjer, kontekst specifikke virkning at udtrykke en eller flere faktorer (effektorer) under kontrol af syntetiske pOp initiativtageren kan vurderes hurtigt, for eksempel i F1 planter af en krydsning mellem en effektor og flere driver linjer. Denne tilgang er eksemplificeret ved den Ektopisk udtryk for VND7, en NAC transskription faktor i stand til at inducere ektopisk secondary celle væg deposition i en celle autonomt.
Introduction
En stor begrænsning i biologi i den postgenomic æra er at dechifrere sammenhæng specifikke rolle en bestemt faktor eller genetiske undertrykkelse af netbårne. Konstituerende genetiske forstyrrelser såsom tab af funktion og gevinst af funktion tilgange ofte kun tillade end-point analyse af livslang tilpasning processer, obfuscating sondringen mellem primære og sekundære virkninger. Derudover kan sammenhæng specifikke funktioner maskeret eller fortyndet med stor skala effekter i fjerntliggende væv eller i andre faser af udvikling. Desuden, i ekstreme tilfælde, dødelighed kan udelukke enhver mekanistiske indblik. Ideelt, for at omgå disse problemer, kunne man analysere effekten af akut genetiske undertrykkelse af netbårne inden for en bestemt sammenhæng som en bestemt celletype på en gang-løst måde. For at opnå dette, er genetiske værktøjer for inducerbar, celle type-specifikke udtryk nødvendigt1. For at give en ressource for hurtig vurdering af en reaktion på en given effektor spatiotemporelle dynamik, har vi kombineret let kloning fra GreenGate system2 med dokumenteret effekten af GR-LhG4 system3, 4,5,6. Vi har genereret et sæt linjer at udtrykke den kimære transskription faktor LhG4 sammenvoksede til ligand bindende domæne af rotte corticoid receptor (GR)7 under kontrol af godt karakteriseret celle type specifikke initiativtagere8. I hvile betingelser, forbliver transskription faktor uden for kernen, som domænet GR er bundet af det cytosole HSP90. Med tilføjelsen af syntetisk ligand dexamethason (Dex), nukleare translokation er induceret og LhG4 vil mægle transskription af udtryk kassetter under kontrol af en beslægtet syntetiske pOp-type promoter, såsom en mTurquoise2 journalist inkluderet i driver linjer til at visualisere domænet udtryk efter induktion. Således indeholde driver linjer teknisk også en effektor kassette. Passage af et sæt driver linjer med en linje, der transporterer en effektor kassette med, for eksempel et gen af interesse inden for samme pOp-type kontrol dermed giver mulighed for hurtig vurdering af de akutte eller langvarige konsekvenser af effektor udtryk i en lang række celletyper.
Her, leverer vi en protokol, der beskriver de procedurer, der er nødvendige for at generere driver og effektor linjerne og demonstrere hvordan celle type specifikke udtryk kan induceret og fulgt i skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium af Arabidopsis. For at illustrere den dygtighed og specificiteten af denne tilgang, vi udnytte den velkendte transskription faktor VND7, som er i stand til at køre vedvævet-lignende secondary celle væg fortykkelser ectopically9. Behandling af F1 fra en krydsning mellem pSCR10,11 driver linje og pOp6:VND7 effektor linje fører til dannelsen af ektopiske vedvævet-lignende celler i den stivelse sheath celler i Arabidopsis stammer.
For at lette generation af store DNA forsamlinger kræves til at konstruere driver og effektor udtryk plasmider, brugte vi den hurtige og effektive GreenGate kloning metode2. GreenGate kloning er baseret på type II S restriktionsenzymer Eco31I eller dens isoschizomer Bsa2. Disse enzymer klippe neden for deres asymmetriske genkendelsessekvenser producerer markiser med varierende base sammensætning. Ved at indarbejde Eco31I /Bsajeg begrænsning sites i oligonukleotider og tildeling af specifikke overhæng sekvenser til DNA elementer, modulære kloning er opnået, at lette generation af store forsamlinger. Inden for rammerne af GreenGate DNA moduler kan inddeles i kategorier A-F baseret på overhæng sekvens, der tjener som adaptere og er samlet i rækkefølgen. Primere designet til at forstærke dit ønskede produkt bør derfor i overensstemmelse med det valgte modul2 (figur 1A). Hvis der er en indre Eco31I /Bsajeg site og rækkefølgen er ikke kompatibel med GreenGate løsning og destination moduler, kan du fortsætte uden mutagenizing, men med lavere effektivitet. Alternativt kan du bruge site-directed mutagenese fjerne Eco31I /Bsajeg begrænsning websteder pas på ikke for at ændre aminosyrer i genprodukter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi de nødvendige skridt til at generere og anvende en alsidig og omfattende toolkit for inducerbar, celle type specifikke trans-aktivering. Passage linjer transporterer effektor kassetter under for pOp med driver linjer kontrol giver mulighed for at studere effekterne mis udtryk i F1 generation, muliggør en hurtig vurdering af genetiske undertrykkelse af netbårne i en lang række celletyper. Alternativt, effektor konstruktioner kan bruges til at omdanne driver linjer, eller ved at tilpa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejde i vores laboratorier er understøttet af tyske Research Foundation (DFG) tilskud WO 1660/6-1 (til S.W.) og GR 2104/4-1 (til T.G.) og SFB1101 (til T.G. og J.U.L) og ved et europæisk forskningsråd samlegodsspeditøren giver (PLANTSTEMS 647148) til T.G. S.W. understøttes gennem Emmy Noether Fellowship af DFG gennem Grant WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
