Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação
Summary
Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.
Abstract
Expressão inducible, tecido-específica é uma ferramenta importante e poderosa para estudar a dinâmica espaço-temporal da perturbação genética. Combinando o GreenGate flexível e eficiente sistema com o comprovada e aferido LhGR sistema (aqui denominado GR-LhG4) para a expressão inducible de clonagem, geraram um conjunto de linhas de Arabidopsis transgênicas que pode guiar a expressão de um efetor gaveta em uma variedade de tipos de célula específica nos três os meristemas planta principal. Para este fim, escolhemos o sistema GR-LhG4 previamente desenvolvido, com base em um fator de transcrição quimérico e cognato pOp-tipo promotor garantindo controlo apertado sobre uma ampla gama de níveis de expressão. Além disso, para visualizar o domínio de expressão onde o fator de transcrição sintética está ativo, um repórter fluorescentes mTurquoise2 ER-localizada sob o controle do promotor pOp4 ou pOp6 é codificado em linhas de motorista. Aqui, descrevemos as etapas necessárias para gerar uma linha de driver ou efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium de Arabidopsis. Usando vários ou todos os driver de linhas, o efeito de contexto específico de expressar um ou múltiplos fatores (efetores) sob controle do promotor sintético pOp pode ser avaliadas rapidamente, por exemplo em plantas de F1 de um cruzamento entre um efetor e múltiplo linhas de motorista. Esta abordagem é exemplificada pela expressão ectópica de VND7, um factor de transcrição do NAC capaz de induzir a deposição de parede ectópica secundária de célula de forma autónoma de célula.
Introduction
Uma grande limitação em biologia na era postgenomic é para decifrar o papel específico do contexto de um determinado fator ou perturbação genética. Perturbações genéticas constitutivas como abordagens da função de perda e ganho-de-função muitas vezes só permitem a análise de ponto de extremidade de processos de adaptação ao longo da vida, ofuscando a distinção entre efeitos primários e secundários. Além disso, funções específicas do contexto podem ser mascaradas ou diluídas por efeitos de grande escala em tecidos distantes ou durante as outras fases do desenvolvimento. Além disso, em casos extremos, a letalidade pode exclui qualquer visão mecanicista. Idealmente, para contornar esses problemas, pode-se analisar o efeito aguda perturbação genética dentro de um contexto específico, como um tipo específico de célula de forma tempo-resolvido. Para conseguir isso, ferramentas genéticas para expressão de tipo específico de célula inducible, são necessários1. Para fornecer um recurso para a rápida avaliação da dinâmica de uma resposta a uma determinado efetoras spatiotemporal, combinamos a facilidade de clonagem fornecidos pelo sistema GreenGate2 com a eficácia comprovada do sistema a GR-LhG4,3, 4,5,6. Podemos ter gerado um conjunto de linhas que expressam o fator de transcrição quimérico que lhg4 fundido para o domínio de ligação do ligante do receptor (GR) corticoide rato7 sob o controle de célula bem caracterizadas de promotores específicos tipo8. Em condições de repouso, o fator de transcrição permanece fora do núcleo, como o domínio GR é ligado pelo HSP90 citosólica. Com a adição de dexametasona ligante sintético (Dex), translocação nuclear é induzida e LhG4 vai mediar a transcrição das fitas de expressão sob controle de um promotor de cognato sintético pOp-tipo , tais como um repórter mTurquoise2 incluídas nas linhas de motorista Visualizar o domínio de expressão após a indução. Assim, as linhas de motorista tecnicamente também contêm uma gaveta effector. O cruzamento de um conjunto de linhas de motorista com uma linha carregando uma gaveta effector com, por exemplo, um gene de interesse sob o controle do promotor pOp-tipo mesmo assim, permite a avaliação rápida das consequências agudas ou a longo prazo da expressão effector em uma ampla gama de tipos de células.
Aqui, nós fornecemos um protocolo descrevendo os procedimentos necessários para gerar as linhas de driver e efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium da Arabidopsis. Para ilustrar a valentia e a especificidade desta abordagem, nós utilizamos o fator de transcrição conhecidos VND7 que é capaz de conduzir o engrossamento em espiral do tipo xilema secundário celular parede ectopically9. Tratamento de F1 de um cruzamento entre o Carbono2grl3vuoluk10,11 motorista e a pOp6:VND7 effector linha leva à formação de células de xilema, como gravidez ectópica na bainha de amido células da Arabidopsis da haste.
Para facilitar a geração de grandes conjuntos de DNA necessária para a construção de plasmídeos de expressão driver e efetoras, usamos o rápido e eficiente GreenGate clonagem método2. GreenGate clonagem é baseado no tipo II S, enzimas de restrição como Eco31I ou sua isoschizomer BsaI2. Estas enzimas cortar a jusante de seus sites de reconhecimento assimétrica produzindo saliências com variando a composição de base. Incorporando o Eco31I /Bsaeu restrição sites em oligonucleotides e alocando sequências específicas saliência para elementos de DNA, clonagem modular é alcançado, facilitando a geração de grandes módulos (assemblies). No quadro GreenGate, módulos de DNA se enquadram em categorias A-F com base na sequência de saliência que servem como adaptadores e são montadas nessa ordem. Portanto, as primeiras demão projetadas para amplificar seu produto desejado devem estar de acordo com o módulo selecionado2 (figura 1A). Se há um interno Eco31I /Bsaeu site e a sequência não é compatível com os módulos de entrada e destino GreenGate, você pode prosseguir sem mutagenizing, mas com menor eficiência. Como alternativa, use o mutagenesis local-dirigido para remover Eco31I /Bsaeu locais de restrição, tomando cuidado para não alterar os aminoácidos em produtos de genes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos os passos necessários para gerar e aplicar um conjunto de ferramentas abrangente e versátil para inducible, célula tipo específico trans-ativação. Atravessando a fronteira transportando cassettes effector sob controle do promotor pOp com linhas de motorista permite estudar os efeitos de expressão mis na geração F1, permitindo a rápida avaliação de perturbação genética em uma ampla gama de tipos de células. Alternativamente, effector construções podem ser usadas para t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho em nossos laboratórios é suportado pelo Fundação de pesquisa alemã (DFG) subvenções WO 1660/6-1 (S.W.) e GR 2104/4-1 (T.G.) e SFB1101 (para T.G. e J.U.L) e por um Conselho Europeu de investigação consolidador conceder (PLANTSTEMS 647148) de T.G. S.W. é suportado através de Emmy Noether comunhão da DFG através de Grant WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
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