Индуцибельной, выражение определенного типа клеток в Arabidopsis thaliana через LhGR-опосредованной транс-активация
Summary
Здесь мы описываем поколения и применение свода трансгенных Arabidopsis thaliana линии благоприятных индуцибельной, ткани конкретных выражение в трех основных меристем и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы, камбий.
Abstract
Индуцибельной, ткани конкретного выражения является важным и мощным инструментом для изучения пространственно временной динамики генетической возмущений. Сочетание гибкой и эффективной GreenGate, клонирование системы с проверенной и протестированные LhGR системы (здесь называют GR-LhG4) для индуцибельной выражения, мы породили ряд трансгенных линий Arabidopsis, которые могут управлять выражение эффекторных Кассета в диапазоне типов конкретных клеток в трех главных растений меристем. С этой целью мы выбрали ранее разработанной GR-LhG4 система, основанная на химерных транскрипционный фактор и родственных поп тип промоутер, обеспечить жесткий контроль над широкий спектр выражение уровня. Кроме того чтобы визуализировать выражение домена, где активен синтетических транскрипционный фактор, флуоресцентные корреспонденту ER-локализованных mTurquoise2 под контролем промотора pOp4 или pOp6 кодируется в линии драйвер. Здесь мы описывают шаги, необходимые для создания драйверов или эффекторных линии и продемонстрировать как конкретное выражение типа клеток может быть индуцированных и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы и камбий Arabidopsis. С помощью нескольких или всех драйверов линии, специфическое действие контекста выражения одного или нескольких факторов (эффекторы) под контролем промотора синтетической поп можно оценить быстро, например F1 растений Креста между одной эффекторных и несколько линии драйвер. Этот подход подтверждается внематочная выражением VND7, НАК транскрипционный фактор способны индуцировать внематочная средних клеток стенки осаждения автономным образом клетки.
Introduction
Одним из основных ограничений в биологии в постгеномную эру является расшифровать конкретную роль контекста данного фактора или генетических возмущений. Учредительного генетических возмущений, таких, как потеря функции и выгоды функция подходы часто только позволяют концевой анализ пожизненный адаптационных процессов, запутывание различие между первичными и вторичными эффектами. Кроме того конкретные функции контекста может быть масках или разбавленный воздействием крупных масштабах в отдаленных тканях или на других этапах развития. Кроме того в крайних случаях, летальность может препятствовать любой механистической проницательность. Идеально чтобы обойти эти проблемы, можно проанализировать эффект острого генетических возмущений в конкретном контексте такие конкретные ячейки типа в духе времени решена. Для достижения этой цели требуется1генетических средства для индуцибельной, выражение определенного типа клеток. Для обеспечения ресурсов для быстрой оценки динамики пространственно-временных ответа на заданный эффекторных, мы объединили легкость клонирования, представленной GreenGate системе2 с доказанной эффективностью системы GR-LhG43, 45,,6. Мы породили набор линий, выражая химерных транскрипционный фактор, который LhG4 сливается с лигандом связывающий домен крысы корковых рецептор (GR)7 под контролем хорошо изученных ячейки типа конкретных промоутеров8. В отдыхая условий, транскрипционный фактор остается вне ядра, как GR домена связана цитозольной HSP90. С добавлением синтетических лигандом дексаметазона (Dex) индуцированной ядерных транслокации и LhG4 будет посредничать транскрипции выражение кассет под контролем промотора родственных синтетической поп типа , таких как репортер mTurquoise2 включены в линии драйвер для визуализации выражение домена после индукции. Таким образом водитель линии технически также содержат эффекторных кассеты. Пересечение набора драйверов линии с линией, перевозящих эффекторных кассету с, например, ген интереса под контролем промотора же поп типа таким образом позволяет быстрой оценки острой или долгосрочных последствий эффекторных выражения в широком диапазоне типов клеток.
Здесь мы предоставляем протокол описания процедур, необходимых для создания линии водителя и эффекторных и продемонстрировать как конкретное выражение типа клеток может быть индуцированных и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы и камбий из Арабидопсис. Чтобы проиллюстрировать доблесть и специфичность данного подхода, мы используем известные транскрипционный фактор VND7, который способен вождения утолщений стены клетки ксилемы как средних ectopically9. Лечение F1 от помесь pSCR10,11 драйвер линией и линией эффекторных pOp6:VND7 приводит к образованию внематочная клетки ксилемы как в оболочке крахмала, что стволовые клетки Arabidopsis .
Для облегчения поколения больших сборок ДНК, необходимые для построения драйвера и эффекторных выражение плазмид, мы использовали быстро и эффективно GreenGate, клонирование метод2. Клонирование GreenGate основаны на тип II S энзимов ограничения такие как эко31I или его isoschizomer Bsa2. Эти ферменты отрезать вниз по течению от их асимметричной признание сайтов производства свесы с различной базовый состав. Включив эко31I /Bsaя ограничения сайтов в олигонуклеотиды и выделения конкретных навеса последовательностей ДНК элементы, Модульная клонирования достигается, содействие поколения больших сборок. В рамках GreenGate ДНК модули делятся на категории, A-F на основе последовательности навеса, которые служат адаптеры и собраны в этом порядке. Таким образом грунты, предназначенные для того чтобы усилить ваш желаемый продукт должен соответствовать выбранный модуль2 (рис. 1A). Если есть внутренней эко31I /Bsaя сайта и последовательность не совместим с модулями записи и назначения GreenGate, вы можете продолжить без mutagenizing, но с более низкой эффективности. Кроме того, для удаления эко31I использовать сайт Направленный мутагенез /Bsaя места ограничения, стараясь не изменять аминокислот в продуктах ген.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь, мы описывают шаги, необходимые для создания и применения универсальный и всеобъемлющий инструментарий для индуцибельной, ячейки типа конкретных транс-активации. Пересечения линий, перевозящих эффекторных кассеты под контролем промотора поп с линии драйвер позволяет …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в нашей лаборатории поддерживается Немецкий исследовательский фонд (DFG) гранты WO 1660/6-1 (с.в.) и GR 2104/4-1 (т.г.) и SFB1101 (для т.г. и J.U.L) и Европейский исследовательский совет консолидатором предоставить т.г. (PLANTSTEMS 647148) С.в. поддерживается через братство Эмми Нётер DFG через Грант WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
