여기, 우리 세대를 설명 하 고 유전자 변형 애기 thaliana 의 집합의 응용 프로그램 세 가지 주요 meristems, 싹 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에는 레이어의 활성화 유도할 수 있는, 조직 관련 식 라인.
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방법 논문
유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
유도할 수 있는, 조직-특정 식은 유전 섭 동 spatio 시간적 역학을 공부 하는 중요 하 고 강력한 도구입니다. 입증 하 고 벤치마킹 LhGR 시스템 (여기 GR LhG4에 게 불리는) 유도할 수 있는 식에 대 한 시스템을 복제 하는 유연 하 고 효율적인 GreenGate 결합, 우리 생성 집합 유전자 변형 애기는 이펙터의 식을 구동할 수 있습니다. 3 주요 식물 meristems에서 특정 세포 유형의 범위에서 카세트. 이 위해, 우리는 공상 전사 인자와 다양 한 식 수준 이상 꽉 컨트롤을 보장 동족 팝업 형 발기인에 따라 이전 개발 된 GR LhG4 시스템을 선택 했다. 또한, 합성 전사 인자 활성 식 도메인을 시각화 하려면 pOp4 또는 pOp6 발기인의 통제는 응급실 지역화 mTurquoise2 형광 기자는 드라이버 라인에 인코딩됩니다. 여기, 우리는 드라이버 또는 이펙터 라인을 생성 하 고 셀 형식 특정 식을 유도 하 고 촬영 정점 분열 조직 뿌리 정점 분열 조직, 애기의 레이어의 다음 수 어떻게 설명 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 사용 하 여 여러 개 또는 모든 드라이버 라인, 하나 표현 컨텍스트 특정 효과 또는 다중 요인 (이펙터) 합성 팝 발기인의 통제 평가 될 수 있다, 예를 들어 한 이펙터 및 다중 사이 십자가의 F1 식물에 드라이버 라인입니다. 이 접근은 VND7, 셀 자율적인 방식으로 소성 2 차 세포 벽 증 착을 유도 할 수 NAC 녹음 방송 요인의 소성 식으로 궁 행.
서론
Postgenomic 시대에 생물학에서 주요 한계는 주어진된 요소 또는 유전 섭 동의 컨텍스트 특정 역할을 해독 이다. 기능 손실 및 이득의 기능 접근 등 제정 유전 섭 종종 평생 적응 프로세스, 기본 및 보조 효과 사이 구별을 난독 처리 끝점 분석 허용. 또한, 컨텍스트 특정 기능 마스크 수 또는 먼 조직에 또는 개발의 다른 단계 동안 대규모 효과 의해 희석. 또한, 극단적인 경우에 치 사 율 어떤 기계적 통찰력을 배제 수 있습니다. 이상적으로, 이러한 문제를 회피 한 수 분석 특정 셀 형식과 같은 특정 컨텍스트 내에서 급성 유전 섭 동 효과 시간 해결 방식. 이를 위해, 유도할 수 있는, 세포 유형 특정 식에 대 한 유전 도구 필요1있습니다. 주어진된 이펙터에 대 한 응답의 spatiotemporal 역학의 급속 한 평가 대 한 리소스를 제공 하 우리는 GR LhG4 시스템3, 의 검증 된 효능 함께 GreenGate 시스템2 에서 제공 하는 복제의 용이성을 결합 4,,56. ....
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프로토콜
벡터 및 모듈 비영리 저장소, Addgene (https://www.addgene.org)에서 얻을 수 있습니다.
1. 복제 GreenGate를 사용 하 여
- 표 1에 나열 된 돌출부를 사용 하 여 디자인 뇌관, 아래 모듈 타입 전용 어댑터 시퀀스 'NNNN' 교체: 앞으로: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 특정 시퀀스 3´, 반전: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + 역 특정 시퀀스 3´ 보완 독서 프레임의 유지 보수를 보장 하기 위해 밑줄이 기지를 추가 합니다.
모듈 돌출부:
참고: 기본 GreenGate 프레임 워크, 6 모듈에서 A-F, 한 식 플라스 미드 (그림 1C)에 공장 변환 벡터 등뼈와 함께 조립 됩니다. 일반적으로, A 모듈 발기인 시퀀스, B-모듈은 N 맨끝 태그 또는 "더미" 시퀀스6, C 모듈 CD, D-모듈 C 터미널 태그 또는 더미, 전자 모듈 종결자, 및 F-모듈 선택의 유전자 변형에 대 한 저항 카세트 항구 것입니다. 식물입니다. 다른 소 단위와 결합에 대 한 어댑터 F 모듈
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결과
GreenGate 복제를 통해 드라이버와 이펙터 라인의 세대
GoldenGate 복제 및 사용 유형 IIS 금지 endonuclease Bsa를 기반으로 하는 시스템을 복제 하는 GreenGate 나 또는 그것의 isoschizomer 에코31I. 효소 생산 돌출부 먼 비대칭 인식 사이트는 돌출부의 기본 구성에서 자유롭게 될 수 있는 선택, 기초 시스템의 모듈화를 형성 한다. 각 PCR 생성 요소, 예를 들어: 발기인 순서, CD, 또는 터미네이터, 먼저 모듈 생성을 금지 다이제스트에 의해 생산 하는 돌출부를 일치 하는 항목을 지정 된 벡터에 삽입 됩니다. Subcloning, 후 보통 6 일치 모듈의 숫자 GreenGate 결 찰 반응 결과 이진 공장 대상 벡터에서 구성의 어셈블리에 사용 됩니다.
드라이버 라인, 모듈 조직 특정 발기인 (점), GR LHG4 전사 인.......
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토론
여기, 우리는 생성 하 고 유도할 수 있는, 세포 유형 특정 트랜스에 대 한 다양 하 고 포괄적인 툴킷 적용 하는 데 필요한 단계를 설명-활성화. 드라이버 라인 팝 발기인의 통제 이펙터 카세트를 들고 경계선을 넘어 다양 한 셀 형식에에서 유전 섭 동의 급속 한 평가 활성화 F1 세대에 잘못 표현 효과 연구 수 있습니다. 또는, 이펙터 구문을 변환 드라이버 라인을 사용할 수 있습니다 또는 복제 전략, 드라이버 및 이펙터 적응 하 여 구조 또한 결합 될 수 있다 1 개의 T-DNA에. 이 시스템에 이르기까지 대 한 응용 프로그램 공간 및 일시적으로 제어 도메인 전용 노크 다운 또는 유전자 편집과 셀 형 특정 보완성을 잘못 표현 연구.
여기에 설명 된 절차 중 실험실 일반적인 분자 생물학 기술에 대 한 장비에 대 한 도전을 포즈를 해야 합니다. LhG4 식 시스템 철저 하 게 테스트 되었습니다 보장과 높은 구동 될 수 있다 비 새 고 tuneable 식.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리의 실험실에 일은 독일 연구 재단 (DFG)에 의해 지원 보조금 WO 1660/6-1 (남서) 및 GR 2104/4-1 (T.G.) 및 SFB1101 (T.G. J.U.L)를 통합 유럽 연구 위원회에 의해 T.G.를 (PLANTSTEMS 647148)를 부여 남서는 그랜트 WO 1660/2 통해 DFG의에 미 뇌터 교제를 통해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| 컬럼 정제 | Qiagen | QIAquick PCR 정제 키트 (250) | |
| 이미징용 배양 챔버 | Sarstedt AG & Co. KG | 1-웰 조직 배양 챔버, 커버 유리 II | |
| 덱사메타손 | 시그마-알드리치 | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, 영국 | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| 주입 캐뉼라(0.30 x 12mm, 30G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO 람다 블루 63x 물 침수 objectiv | Leica, Wetzlar, 독일 | ||
| MS 매체 | Duchefa, Haarlem, 네덜란드 | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA 물 침수 목표 | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| 페트리 접시 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, 독일 | 627102 | |
| 페트리 접시 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, 독일 | 628102 | |
| 페트리 접시 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, 독일 | 688102 | |
| Plant 한천 | Duchefa, 하를렘, 네덜란드 | P1001 | |
| 플라스미드 추출 | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| 반응관 | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| 분광 광도계 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| 설탕 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µ l | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 리가아제 30 U/&마이크로; l | 써모 피셔 사이언티픽 | EL0013 |
참고문헌
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.<....
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재인쇄 및 허가
