İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek
Summary
Burada, biz üretimi tarif ve transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi uygulama etkinleştirme indüklenebilir, doku özel ifade üç ana sürgen, sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium satırları.
Abstract
İndüklenebilir, doku özel ifade genetik pertürbasyon spatio-zamansal dinamiği eğitim için önemli ve güçlü bir araçtır. (Burada GR-LhG4 denir) kanıtlanmış ve eşdeğerlik LhGR sistem indüklenebilir mesaj sistemiyle klonlama esnek ve verimli GreenGate bir araya getiren bir efektör ifade sürebilirim transgenik Arabidopsis satırlar üretilip üç ana bitki sürgen türlerinde belirli hücre aralığındaki kaset. Bu amaçla, biz chimeric transkripsiyon faktörü ve geniş bir ifade düzeyleri üzerinde sıkı kontrol sağlanması bir soydaş pOp-türü organizatörü göre daha önce gelişmiş GR-LhG4 sistemi seçti. Ayrıca, sentetik transkripsiyon faktörü etkin olduğu ifade etki alanı görmek için pOp4 veya pOp6 düzenleyicinin kontrolü altında bir ER lokalize mTurquoise2 floresan muhabir sürücü satırları içinde kodlanır. Burada, bir sürücü veya efektör satırı oluşturmak ve nasıl hücre türü belirli ifade indüklenen olabilir ve sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve Arabidopsiscambium göstermek için gereken adımları açıklar. Kullanarak birkaç veya tüm sürücü satırları, bir ifade bağlam belirli etkisi veya Multipl faktörler (effectors) sentetik pOp düzenleyicinin kontrolü altında hızla, örneğin bir efektör ve çoklu arasında bir haç F1 tesislerinde tespit edilebilir sürücü satırları. Bu yaklaşım ile VND7, NAC transkripsiyon faktörü bir hücre özerk şekilde Ektopik ikincil hücre duvar ifade ikna yeteneğine sahip Ektopik ifade örneklenir.
Introduction
Biyolojide önemli bir sınırlama postgenomic dönemde verilen faktörü veya genetik pertürbasyon bağlam belirli rolü deşifre etmektir. Kurucu genetik tedirginlikler işlev kaybı ve işlev kazanç yaklaşımlar gibi genellikle sadece ömür boyu uyum süreçleri, birincil ve ikincil etkileri arasında ayrım obfuscating son nokta analizi sağlar. Buna ek olarak, bağlam belirli işlevleri maskeli veya büyük ölçekli etkileri uzak dokularda veya diğer geliştirme aşamaları ile seyreltilmiş. Ayrıca, aşırı durumlarda, herhangi bir mekanik kavrama ölümcül engel. İdeal olarak, bu sorunları aşmak için bir akut genetik pertürbasyon belirli hücre türü gibi belirli bir bağlam içinde etkisini zaman çözülmüş bir şekilde analiz edebilirsiniz. Bunu başarmak için genetik indüklenebilir, hücre türüne özgü ifade için gerekli1araçlardır. Bir yanıt-e doğru belirli bir efektör kronolojik zamanmekansal dinamikleri hızlı değerlendirilmesi için bir kaynak sağlamak için biz-si olmak kombine tarafından GreenGate sistem2 GR-LhG4 sistemi3, kanıtlanmış etkinliği ile sağlanan klonlama kolaylığı 4,5,6. Biz-si olmak oluşturmak LhG4 ligand bağlayıcı etki iyi karakterize hücre türü belirli rehberleri8kontrol altında fare Kortikoid reseptör (GR)7 erimiş chimeric transkripsiyon faktörü ifade satırlar. GR etki alanı sitozolik HSP90 tarafından bağlı olarak koşulları dinlenme, transkripsiyon faktörü çekirdeği dışında kalır. Sentetik ligand deksametazon (Dex) eklenmesiyle, nükleer translocation indüklenen ve LhG4 transkripsiyon ifadesi kaset bir mTurquoise2 muhabir gibi bir soydaş sentetik pOp-türü düzenleyici denetimi altında arabuluculuk indüksiyon sonra ifade etki alanı görselleştirmek için sürücü satırları dahil. Böylece, sürücü satırları teknik olarak da bir efektör kaset içerir. Sürücü satırları böylece bir efektör kaset ile örneğin, aynı pOp-türü düzenleyici denetimi altında ilgi bir gen taşıyan bir satırı ile bir dizi geçiş efektör ifade akut veya uzun vadeli sonuçları hızlı bir değerlendirme sağlar içinde çok çeşitli hücre tiplerinin.
Burada, sürücü ve efektör satırları oluşturmak ve nasıl hücre türü belirli ifade indüklenen olabilir ve sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium, takip göstermek için gerekli prosedürleri açıklayan bir protokol sağlar Arabidopsis. Cesaret ve özgüllüğü bu yaklaşım göstermek için biz yararlanmak iyi bilinen transkripsiyon faktörü xylem gibi ikincil hücre duvar thickenings ectopically sürüş yeteneğine sahip olan VND79. PSCR10,11 sürücü çizgi ile pOp6:VND7 efektör çizgi arasında çapraz gelen F1 tedavi Ektopik xylem benzeri hücrelere kök hücre Arabidopsis nişasta kılıf oluşumunu yol açar.
Sürücü ve efektör ifade plazmidleri oluşturmak için gerekli büyük DNA derlemeleri nesil kolaylaştırmak için kullandığımız yöntem2klonlama hızlı ve verimli GreenGate. GreenGate klonlama dayalı tip II S enzimleri Eko31I veya onun isoschizomer Bsagibi ben2. Bu enzimler asimetrik tanıma sitelerinin temel kompozisyon değişen çıkıntılar üreten aşağı akım kesme. Eko31I birleşmeyle tarafından /Bsaben kısıtlama siteleri içinde oligonucleotides ve DNA öğeleri belirli çıkıntı serileri tahsis etme, modüler klonlama, büyük grupları oluşturmayı kolaylaştırmak elde edilir. GreenGate framework, DNA modülleri bağdaştırıcıları olarak hizmet ve bu sıraya göre monte edilir A-F çıkıntı sıralamasına dayanan kategori içine düşmek. Bu nedenle, istenen ürününüzü yükseltmek için tasarlanmış astar seçilen modül2 uygun olarak (şekil 1A) olmalıdır. Bir iç Eko31I / ı siteBsave sırası GreenGate giriş ve hedef modüller ile uyumlu değildir, mutagenizing olmadan, ama daha düşük verimlilik ile devam edebilirsiniz. Alternatif olarak, Eko31I kaldırmak için site yönettiği mutagenesis kullanın /Bsaben kısıtlama siteleri amino asitler gen ürünlerde değiştirmemeniz için dikkat çekici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, çok yönlü ve kapsamlı araç seti indüklenebilir, hücre türü belirli transiçin görüntüsünü oluşturmak ve gerekli adımları açıklamak-harekete geçirmek. Efektör kaset sürücü satırları ile pOp düzenleyicinin kontrolü altında taşıma hatları geçiş yanlış ifade etkileri geniş bir hücre tiplerinin genetik pertürbasyon hızlı değerlendirilmesi etkinleştirme F1 nesil eğitim sağlar. Alternatif olarak, efektör yapıları sürücü satırları dönüştürmek içi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuarlarımızda çalışmalarında Almanca Araştırma Vakfı (DFG) tarafından desteklenen hibe WO 1660/6-1 (S.W.) ve GR 2104/4-1 (TG) ve SFB1101 (için TG ve J.U.L) ve Avrupa Araştırma Konseyi tarafından consolidator vermek (PLANTSTEMS 647148) TG için S.W. DFG Grant WO 1660/2 aracılığıyla Emmy Noether Kardeşliği aracılığıyla desteklenir.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
