ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.
Abstract
Mitophagy הוא מסלול חיוני בקרת איכות מיטוכונדריאלי, אשר חיוני עבור התא ביתא איון הלבלב ביואנרגיה כדי דלק מגורה ממריצים אינסולין שחרור. הערכה של mitophagy הוא מאתגר ולעתים קרובות דורש כתבים גנטיים או טכניקות משלימים מרובים לא מנוצל בקלות בדגימות רקמות, כגון איואי הלבלב האנושי העיקרי. כאן אנו להפגין גישה חזקה כדי להמחיש ומכמת היווצרות של מתחמי מפתח אנדוגניים מרכזיים באיים הלבלב האנושי העיקרי. ניצול הקירבה רגישות לסדר שיטת החיבור כדי לזהות אינטראקציה של הרגולטורים mitophagy NRDP1 ו USP8, אנחנו מסוגלים במיוחד לכמת היווצרות מתחמי mitophagy חיוניים באתרו. על-ידי צימוד גישה זו כדי להכתים את גורם התמלול PDX1, אנחנו יכולים לכמת את מתחמי mitophagy, ואת הגורמים שיכולים לפגוע mitophagy, במיוחד בתוך תאי בטא. המתודולוגיה שאנו מתארים מתגבר על הצורך בכמויות גדולות של תמציות הסלולר הנדרשות למחקרים של חלבון-חלבון אחרים, כגון immunoprecipitation (IP) או ספקטרומטר מסה, והוא אידיאלי לדגימות של איון אנושי יקרות בדרך כלל לא זמינים בכמויות מספיקות עבור גישות אלה. יתרה מזאת, מתודולוגיה זו בדקה את הצורך בטכניקות מיון זרימה כדי לטהר את תאי הבטא מאוכלוסיית איון הטרוגנית עבור יישומי החלבון במורד הזרם. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול רב ערך עבור ויזואליזציה של mitophagy תואם מאוד לשימוש באוכלוסיות תאים הטרוגנית ומוגבלת.
Introduction
תאים ביתא הלבלב לייצר את האינסולין הנדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז נורמלי, וכישלון שלהם תוצאות בפיתוח של כל צורות הסוכרת. תאי בטא שומרים על קיבולת מיטוכונדריאלי חזקה כדי ליצור את האנרגיה הדרושה לחילוף החומרים של גלוקוז עם שחרור אינסולין. לאחרונה, זה התברר כי התחזוקה של מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי היא בעלת חשיבות מרכזית עבור הפונקציה האופטימלית של תא ביתא1,2,3. על מנת לקיים מסה מיטוכונדריאלי פונקציונלי, תאי בטא להסתמך על מנגנוני בקרת איכות כדי להסיר תפקוד, פגום, או הזדקנות המיטוa4. אנחנו ואחרים הוכיחו בעבר כי תאים ביתא להסתמך על צורה מיוחדת של מחזור מיטוכונדריאלי, הנקרא הוראות מיטוכונדריאלי (או mitophagy), כדי לשמור על איכות מיטוכונדריאלי בקרת מכרסמים והאדם האנושי1, 2,5. למרבה הצער, עם זאת, לא היתה שיטה פשוטה כדי לזהות mitophagy, או באופן מידי הביע רכיבים mitophagy, בתאי בטא הלבלב האנושי.
לאחרונה הראינו כי במעלה הזרם של mitophagy בתאי ביתא מסתמך על היווצרות של מתחם חלבון הכולל את E3 ליגסים CLEC16A ו NRDP1 והוא USP81. NRDP1 ו USP8 הוכחו באופן עצמאי להשפיע mitophagy באמצעות פעולה על מפתח מיאופלגיה מיזם parkin6,7. NRDP1 מטרות PARKIN עבור אוביקווינציה והשפלה כדי לכבות את mitophagy6, ו USP8 במיוחד באופן בלתי מקושר K6-parkin לקדם את הטרנסלוקציה שלה כדי המיטומטר7. שיטת החיבור הצמוד (PLA) הטכנולוגיה היתה מקדמה לאחרונה בתחום של אינטראקציה חלבון ביולוגיה8, המאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות חלבונים אנדוגניים באתרו תאים בודדים, והוא אינו מוגבל על ידי חומר לדוגמה נדירים. מתודולוגיה זו מפתה במיוחד לביולוגיה של האדם/תא ביתא, בשל הספניות של זמינות המדגם, ביחד לצורך הבנת מתחמי חלבון רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית בתוך סוגי תאים הטרוגנית.
ניצול הגישה PLA, אנחנו מסוגלים להתבונן מרכזי מפתח אנדוגניים מתחמי בתאי בטא הלבלב האנושי העיקרי וקווי התאים עצביים, ולהדגים את ההשפעות של סביבה diabetogenic על מסלול מיטואופג’י1. לסיכום, מטרת היסוד של פרוטוקול זה היא לנתח מתחמי חלבון mitophagy ספציפיים ברקמות חסר חומר שופע, או כאשר מחקרים קונבנציונאלי-חלבון האינטראקציה אינם אפשריים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים גישה פשוטה ויעילה לשימוש NRDP1: USP8 PLA ברקמות/תאים של עניין היווצרות מכמת של מכלולי mitophagy במעלה. בעבר אישרו את היווצרות של מורכבות CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy בתאי ביתא הלבלב על ידי כמה מתודולוגיות, כולל שיתוף immunoprecipitation ניסויים, תא ללא אינטראקציה לימודי, וחוץ גופית, כמו גם תא מבוסס והפגינו כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בתמיכת JDRF (CDA-2016-189 וסרה-2018-539), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות, המכונים הלאומיים לבריאות (R01-DK-108921), משפחת Brehm, ומשפחת אנטוני. פרס לפיתוח קריירה JDRF ל-S.A.S. נתמך בחלקו על ידי האקדמיה לסוכרת דנית, אשר נתמכת על ידי קרן נובו Nordisk.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. , (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a., G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -. E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
