Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes
Summary
Ce test de mise à mort d’opsonophagocytic est utilisé pour comparer la capacité des cellules immunitaires phagocytaires de répondre à et de tuer les bactéries issus des différents traitements et/ou des conditions. Classiquement, ce test sert de l’étalon-or pour évaluer les fonctions effectrices des anticorps contre une bactérie comme opsonine.
Abstract
Un aspect clé de la réponse immunitaire à une colonisation bactérienne de l’hôte est la phagocytose. Un test de mise à mort d’opsonophagocytic (OPKA) est une procédure expérimentale dans laquelle les cellules phagocytaires sont conjointement cultivés avec unités bactériennes. Les cellules immunitaires vont phagocyter et tuer les cultures bactériennes d’une manière dépendante du complément. L’efficacité de l’assassinat de cellule immunitaire dépend de plusieurs facteurs et peut être utilisée pour déterminer comment les différentes bactéries comparer les cultures en ce qui concerne la résistance à la mort cellulaire. De cette façon, l’efficacité du potentiel immunitaire base thérapeutique peut être évaluée contre les souches bactériennes spécifiques et/ou des sérotypes. Dans ce protocole, nous décrivons une OPKA simplifiée qui utilise des conditions de culture de base et de la cellule de comptage pour déterminer la viabilité cellulaire bactérienne après co-culture avec des conditions de traitement et HL-60 cellules immunitaires. Cette méthode a été utilisée avec succès avec un certain nombre de différents sérotypes pneumococciques, capsulaires et capsulée souches et d’autres espèces bactériennes. Les avantages du présent protocole OPKA sont sa simplicité, polyvalence (comme ce test n’est pas limité aux traitements d’anticorps comme opsonines) et la minimisation du temps et de réactifs pour évaluer les groupes expérimentaux de base.
Introduction
L’opsonophagocytic tuant assay (OPKA) est un outil essentiel permettant de relier des altérations de la structure bactérienne ou une fonction aux modifications ultérieures dans la réponse immunitaire et la fonction. À ce titre, il sert souvent une analyse complémentaire afin de déterminer l’efficacité immunitaire basé sur des traitements d’anticorps, vaccins expérimentaux, optimisation de l’enzyme, etc.. Alors que les essais in vivo sont nécessaires pour déterminer la clairance apparente ou protection dans un modèle d’infection bactérienne, le OPKA peut être utilisé pour évaluer la contribution immunisée à la mort de la cellule bactérienne composants à la base : les bactéries, les cellules immunitaires et expérimentale traitements. Des études antérieures ont montré que OPKAs peuvent être modifiées et utilisés pour une variété de bactéries et sérotypes, dont Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus,2,3de la Pseudomonas aeruginosa. En outre, ces dosages optimisés peuvent servir à évaluer différents traitements expérimentaux, y compris la capacité d’une enzyme pour faciliter l’accès aux cellules immunitaires médiée par le complément4 anticorps traitements et pour améliorer la bactérie opsonisation5. Classiquement, le dosage OPKA a été utilisée avec succès dans la recherche fondamentale et clinique paramètres comme un puissant indicateur de protection induite par des anticorps spécifiques6,7,8,9 .
Différents types de cellules immunitaires peuvent servir pour l’évaluation de l’assassinat d’opsonophagocytic. Une population phagocytaire couramment utilisée est la ligne de cellules leucémiques humaines HL-60. Cette lignée cellulaire peut être gardée comme promyélocytes inactivé en culture ; Toutefois, ils peuvent être différenciés dans divers États activés par l’intermédiaire de différents médicaments traitements10,11. Traitement des HL60 avec N, N-diméthylformamide différencie de la lignée cellulaire en neutrophiles activés avec forte activité phagocytaire11. Tandis que les cellules HL-60 ont été optimisés et sont fréquemment utilisés pour ces essais de phagocytose10, autres leucocytes polymorphonucléaires primaires peuvent être utilisés comme le bras immunitaire de l’ expérience12.
En outre, ces tests peuvent être simplifiées13 ou multiplexés14 à regarder de nombreuses souches résistantes aux antibiotiques des bactéries à tester. La méthode multiplexée ont été réalisée en plus faisable grâce à l’élaboration d’un logiciel qui peut compter efficacement la colonie bactérienne formant des unités (UFC) par endroit sur une plaque de gélose15. Nous décrivons ici une méthode simplifiée utilisant une souche bactérienne, les cellules HL-60, complément de bébé lapin et géloses au sang. Avec cette méthode, plusieurs traitements peuvent être évalués rapidement pour répondre à des questions de recherche spécifiques sur la façon dont la réponse immunitaire innée à l’infection bactérienne peut être modulée.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs servir un rôle essentiel dans l’évaluation de médiation immunitaire d’anticorps induits par les vaccins6,8. La signification fondamentale de ce OPKA simplifiée est la capacité d’adaptation dans les conditions à tester (anticorps, traitements enzymatiques, etc..). En ce sens, bien que ce test peut être utilisé pour tester la contribution des opsonines (c.-à-d., anticorps) dans la phagocytose, également utilisable pour évaluer les moyens de s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions m. Moon Nahm (Université de l’Alabama, Birmingham) pour son aide précieuse dans l’établissement de tests OPKA dans notre laboratoire. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé Grant 1R01AI123383-01 a 1 à FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
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