Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten
Summary
Dieser Opsonophagocytic Tötung Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der phagocytic Immunzellen zur Beantwortung und töten Bakterien basierend auf verschiedene Behandlungen und/oder Bedingungen zu vergleichen. Klassisch, dient dieser Assay als der Goldstandard für die Beurteilung der Effektor-Funktionen von Antikörpern gegen ein Bakterium als Opsonin erhoben.
Abstract
Ein wesentlicher Aspekt der Immunantwort auf bakterielle Besiedlung des Gastgebers ist Phagozytose. Ein Opsonophagocytic-Tötung-Assay (OPKA) ist ein experimentelles Verfahren, in dem phagocytic Zellen mit bakteriellen Einheiten Co kultiviert sind. Die Immunzellen werden phagozytieren und töten die Bakterienkulturen in einer Ergänzung-abhängigen Weise. Die Effizienz der immun-vermittelte Zelle Tötung ist eine Reihe von Faktoren abhängig und kann verwendet werden, um festzustellen, wie die verschiedenen bakteriellen Kulturen zu vergleichen, in Bezug auf Widerstand zum Zelltod führt. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von potenziellen immun-basierten Therapeutika gegen bestimmte Bakterienstämme und/oder Serotypen beurteilt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine vereinfachte OPKA, die grundlegende Kulturbedingungen und Zelle zählen, um bakterielle Zellviabilität nach Kokultur mit Behandlung und HL-60 Immunzellen bestimmen verwendet. Diese Methode wurde erfolgreich mit einer Reihe von verschiedenen Pneumokokken-Serotypen, Kapsel und Acapsular Stämme und andere Bakterienarten genutzt. Die Vorteile dieses OPKA-Protokolls sind seine Einfachheit, Vielseitigkeit, (da dieser Test auf Antikörper Behandlungen wie Opsonins nicht beschränkt), und Minimierung von Zeit und Reagenzien zu grundlegenden experimentelle Gruppen zu beurteilen.
Introduction
Die Opsonophagocytic töten Assay (OPKA) ist ein wichtiges Werkzeug für spätere Änderungen der Immunantwort und Funktion Änderungen in bakteriellen Struktur oder Funktion verlinken. Als solche häufig dient es als eine ergänzende Assay immun-basierte Wirksamkeit von Antikörper-Therapien, Impfstoffkandidaten, Enzym-Optimierung zu bestimmen. In-vivo-Tests sind notwendig, um effektive Räumung oder Schutz in eine bakterielle Infektion-Modell zu bestimmen, kann die OPKA verwendet werden, um immun Beitrag zur bakteriellen Zelltod zu den grundlegende Komponenten bewerten: Bakterien, Immunzellen, und experimentelle Behandlungen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die OPKAs geändert und für eine Vielzahl von Bakterien und Serotypen, darunter Streptococcus Pneumoniae1, Staphylococcus Aureus2, Pseudomonas Aeruginosa3verwendet werden kann. Darüber hinaus können diese optimierten Assays verwendet werden, um verschiedene experimentelle Behandlungen, einschließlich der Möglichkeit eines Enzyms, das Bakterium zugänglicher zu ergänzen-vermittelten immunen Zellen4 und Antikörper-Behandlungen zur Verbesserung machen bewerten Opsonization5. Klassisch, OPKA Assay erfolgreich eingesetzt in der Grundlagenforschung und klinische Forschung Einstellungen als ein aussagekräftiger Indikator für Schutz induziert durch Erreger-spezifischen Antikörper6,7,8,9 .
Verschiedene Arten von Immunzellen können zur Beurteilung der Opsonophagocytic töten verwendet werden. Eine häufig verwendete phagocytic Bevölkerung ist der HL-60 menschlichen leukämischen Zell-Linie. Diese Zelllinie kann als inaktivierte Promyelocytes in Kultur gehalten werden; jedoch können sie in verschiedene aktivierte Zustände über verschiedene Drogen Behandlungen10,11unterschieden werden. Behandlung von HL60 mit N, N-Dimethylformamid unterscheidet die Zellinie in aktivierten Neutrophilen mit starken phagocytic Aktivität11. Während HL-60 Zellen optimiert wurden und werden häufig für die Phagozytose Assays10verwendet, können andere primäre polymorphkernigen Leukozyten als immun Arm der Experiment-12verwendet werden.
Darüber hinaus können diese Assays vereinfachte13 oder14 betrachten mehrere Antibiotika-resistente Bakterienstämme der zu prüfenden gemultiplext. Die Multiplex-Methode worden eher möglich durch die Entwicklung von Software erzielt, die effizient bakterielle Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Spot auf einem Agar-Platte15zählen kann. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode mit ein Bakterienstamm, HL-60-Zellen, Baby-Kaninchen-Ergänzung und Blutagar Platten. Mit dieser Methode können mehrere Behandlungen schnell beurteilt werden, um spezifische Forschung Fragen auf wie der angeborenen Immunantwort auf bakterielle Infektion moduliert werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs dienen die entscheidende Rolle bei der Beurteilung der Antikörper-vermittelten Immunantwort induziert durch Impfungen6,8. Die Hauptbedeutung dieser vereinfachten OPKA ist die Anpassungsfähigkeit der Bedingungen getestet werden (d. h., Antikörper, Enzym-Behandlungen). In diesem Sinne während dieser Assay verwendet werden kann, um den Beitrag von Opsonins (z.B. Antikörper) in Phagozytose, testen sie auch lässt sich beurteilen, Wege zur Überwindung von …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) für seine unschätzbare Hilfe bei der Gründung OPKA Tests in unserem Labor. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grant 1R01AI123383-01A1, FYA unterstützt.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
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