Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için
Summary
Bu opsonophagocytic öldürme tahlil yeteneği yanıt ve farklı tedaviler ve/veya koşullar üzerinde temel bakterileri öldürmek için fagositik bağışıklık hücrelerinin karşılaştırmak için kullanılınır. Klasik, bu tahlil bir bakteri bağlar olarak karşı kaldırdı antikorlar efektör fonksiyonları değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.
Abstract
Bir anahtar için ev sahibi bakteriyel kolonizasyon bağışıklık yanıtının fagositoz yönüdür. Bir opsonophagocytic öldürme tahlil (OPKA) Fagositlerlerce bakteriyel birimleriyle işbirliği kültürlü olan deneysel bir işlemdir. Bağışıklık hücreleri phagocytose ve bakteri kültürleri bir tamamlayıcı bağlı şekilde öldürmek. İmmün aracılı hücre öldürme verimliliğini bir dizi faktöre bağlıdır ve ne kadar farklı bakteriyel belirlemek için kullanılan kültürler karşılaştırmak direnç hücre ölümü ile ilgili olarak. Bu şekilde, potansiyel bağışıklık tabanlı tedavi etkinliğinin belirli bakteri suşları ve/veya serotipleri karşı tespit edilebilir. Bu protokol için temel kültür koşulları ve tedavi koşulları ve HL-60 bağışıklık hücreleri ile ortak kültür sonra bakteri hücre canlılığı belirlemek için sayma hücre kullanır bir basitleştirilmiş OPKA açıklar. Bu yöntem başarılı bir şekilde birkaç farklı pnömokok serotipleri, kapsül ve acapsular suşları ve diğer bakteriyel türler ile kullanıldığında vardır. (Bu tahlil antikor tedavisi opsonins olarak sınırlı değildir) bu OPKA Protokolü avantajları sadeliği çok yönlülük şunlardır ve zaman ve temel deneysel grupları değerlendirmek için reaktif indirilmesi.
Introduction
Tahlil (OPKA) öldürme opsonophagocytic bağışıklık yanıtı ve fonksiyon sonraki değişiklikler değişiklikler bakteriyel yapısı veya işlev bağlamak için önemli bir araçtır. Bu nedenle, bu sık sık antikor tedavisi, aşı adaylar, enzim optimizasyonu, vb bağışıklık tabanlı etkinliğini belirlemek için tamamlayıcı bir tahlil olarak kullanılır. İçinde vivo deneyleri etkili temizleme veya koruma bir bakteriyel enfeksiyon modeli belirlemek gerekli olmakla birlikte, OPKA bakteriyel hücre ölümü bağışıklık katkısı en temel bileşenleri değerlendirmek için kullanılabilir: bakteri, bağışıklık hücreleri ve deneysel tedaviler. Önceki çalışmalarda OPKAs değiştiren ve bakteri ve serotipleri, Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3de dahil olmak üzere çeşitli için kullanılan göstermiştir. Ayrıca, bu en iyi duruma getirilmiş deneyleri bakteri Kompleman aracılı bağışıklık hücreleri4 ve antikor tedavileri geliştirmek için daha erişilebilir kılan bir enzim da dahil olmak üzere farklı deneysel tedaviler değerlendirmek için kullanılabilir opsonizasyonla5. Klasik, OPKA tahlil başarıyla temel ve klinik araştırmada kullanılmıştır ayarları korumak için güçlü bir göstergesi olarak indüklenen patojen özel antikorlar6,7,8tarafından,9 .
Bağışıklık hücreleri türleri opsonophagocytic öldürme değerlendirilmesi için kullanılan. Bir sık kullanılan fagositik nüfus HL-60 insan lösemik hücre çizgidir. Bu hücre kültürünü Inaktif promiyelosit kültür olarak tutulabilir; Ancak, onlar farklı ilaç tedavisi10,11ile çeşitli aktif Birleşik Devletleri içine farklı. Tedavisi HL60 n, N-dimethylformamide içine güçlü fagositik aktivite11ile aktif nötrofil hücre ayırır. HL-60 hücreleri optimize edilmiştir ve bu fagositoz deneyleri10için sık sık kullanılır, diğer birincil polimorfonükleer lökosit12deneme bağışıklık kolu olarak kullanılabilir.
Ayrıca, bu deneyleri Basitleştirilmiş13 olabilir veya test edilecek bakterilerin birden çok antibiyotik dirençli suşların bakmak için14 multiplexed. Çoğaltılmış yöntemi daha verimli bir şekilde bakteriyel koloni başına bir agar plaka15oracıkta birimleri (CFUs) oluşturan güvenebilirsiniz yazılım geliştirme yoluyla uygun hale getirilmiştir. Burada, bir bakteriyel zorlanma, HL-60 hücreleri, bebeği tavşan tamamlayıcı ve kan Ağar kaplamalar kullanarak akıcı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemle, birden fazla tedavi hızlı bir şekilde nasıl bakteriyel enfeksiyon doğuştan gelen bağışıklık yanıtı modülasyonlu üzerinde belirli araştırma soruları gidermek tespit edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs antikor aracılı bağışıklık yanıtı aşılar6,8tarafından indüklenen değerlendirmede önemli roller hizmet. Adaptasyon koşullarında test edilecek bu Basitleştirilmiş OPKA ana önemi nedir (antikorlar, enzim tedavisi, vs.). Bu tahlil opsonins (yani, antikorlar) katkısını fagositoz içinde test etmek için kullanılan bu anlamda, bu da normalde fagositik yolları inhibe virülans faktörleri (yani kapsüler polisakkaritler) aşmak için yolla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) bizim laboratuvar deneyleri OPKA kurulmasında çok değerli onun yardım için teşekkür. Bu eser FYA için Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1R01AI123383-01A1 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
