Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel
Summary
Roman, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken zoals de ultieme 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen toestaan de 3D-visualisatie van rabiësvirus herseninfectie en zijn complexe cellulaire omgeving. Dikke, antilichaam gelabelde hersenweefsel segmenten zijn optisch transparant gemaakt om de beeld diepte te vergroten en 3D-analyse mogelijk te maken door confocale laser scanning microscopie.
Abstract
De visualisatie van infectie processen in weefsels en organen door immunolabeling is een belangrijke methode in de moderne infectie biologie. De mogelijkheid om de verdeling, het tropisme en de overvloed van pathogenen in orgaan weefsels te observeren en bestuderen, verschaft cruciale gegevens over ziekte ontwikkeling en progressie. Met conventionele microscopie methoden is immunolabeling meestal beperkt tot dunne secties die zijn verkregen uit met paraffine ingesloten of bevroren monsters. Het beperkte 2D-beeldvlak van deze dunne secties kan echter leiden tot het verlies van cruciale informatie over de complexe structuur van een geïnfecteerd orgaan en de cellulaire context van de infectie. Moderne Multicolor, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken bieden nu een relatief snelle en goedkope manier om high-volume 3D-beeld stapels van virus-geïnfecteerde orgaanweefsel te bestuderen. Door het weefsel bloot te stellen aan organische oplosmiddelen, wordt het optisch transparant. Dit komt overeen met de brekingsindices van het monster en leidt uiteindelijk tot een significante reductie van lichtverstrooiing. Dus, in combinatie met lange vrije-afstands doelstellingen, kunnen grote weefsel delen tot 1 mm in grootte worden afgebeeld door conventionele confocale laser scanning microscopie (CLSM) bij hoge resolutie. Hier beschrijven we een protocol om Deep-tissue-beeldvorming toe te passen na weefsel clearing om rabiësvirus distributie in geïnfecteerde hersenen te visualiseren om onderwerpen als virus pathogenese, verspreiding, tropisme en neuro invasies te bestuderen.
Introduction
Conventionele histologie technieken vertrouwen meestal op dunne delen van orgaan weefsels, die inherent alleen 2D-inzichten kunnen bieden in een complexe 3D-omgeving. Hoewel het in principe haalbaar is, vereist 3D-reconstructie van seriële dunne secties veeleisende technische pijpleidingen voor zowel snijden als daaropvolgende in silico-uitlijning van de verkregen beelden1. Bovendien is een naadloze reconstructie van z-volumes na microtoom-snijden cruciaal omdat zowel mechanische als computationele artefacten kunnen blijven vanwege suboptimale beeldregistratie veroorzaakt door niet-overlappende afbeeldings vlakken, kleurings variaties en fysieke vernietiging van weefsel door bijvoorbeeld het mes van de microtoom. Zuiver optisch snijden van intacte dikke weefselmonsters zorgt daarentegen voor de verwerving van overlappende beeld vlakken (oversampling) en vergemakkelijkt daarmee de 3D-reconstructie. Dit, op zijn beurt, is zeer gunstig voor de analyse van infectie processen in complexe celpopulaties (bijvoorbeeld neuronale netwerken in de context van de omringende gliacellen en immune cellen). Echter, inherente obstakels van dikke weefsel secties omvatten lichtverstrooiing en beperkte antilichaam penetratie in het weefsel. In de afgelopen jaren is een verscheidenheid aan technieken ontwikkeld en geoptimaliseerd om deze problemen te overwinnen2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. in wezen worden doelweefsels optisch transparant gedraaid door middel van een behandeling met ofwel waterige2,3,4,5,6,7 ,8,9 of op organische oplosmiddelgebaseerde 10,11,12,13 oplossingen. De introductie van 3disco (3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)11,12 en zijn opvolger udisco (Ultimate 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)13 voorzag in een relatief snelle, eenvoudige en goedkope tool met uitstekende clearing mogelijkheden. De belangrijkste bestanddelen van het clearing protocol zijn de organische oplosmiddelen tert-butanol (TBA), benzylalcohol (BA), Benzylbenzoaat (BB) en difenyl ether (DPE). De ontwikkeling en toevoeging van iDISCO (immunolabeling-enabled 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)14, een compatibel immunokleurings protocol, vormde een ander voordeel ten opzichte van bestaande methoden en stelde de diepe weefsel etikettering van antigenen van belang, evenals de lange termijn opslag van immuunbevlekte monsters. Zo zorgt de combinatie van iDISCO14 en udisco13 voor de beeldvorming met hoge resolutie van antilichaam-gelabelde eiwitten in grote weefsel secties (tot 1 mm) met conventionele CLSM.
Het behoud van de complexe structuur van een orgel in alle drie de dimensies is vooral belangrijk voor hersenweefsel. Neuronen bestaan uit een zeer heterogene cellulaire subpopulatie met zeer uiteenlopende 3D-morfologieën op basis van hun neuriet projecties (beoordeeld door Masland15). Bovendien bestaat de hersenen uit een aantal compartimenten en subcompartimenten, elk samengesteld uit verschillende cellulaire subpopulaties en ratio’s daarvan, met inbegrip van gliacellen en neuronen (beoordeeld door von Bartheld et al.16). Als een trope virus, het rabiësvirus (rabv, beoordeeld door Fooks et al.17) infecteert voornamelijk neuronen, met behulp van hun transportmachines te reizen in retrograde richting langs axonen van de primaire site van infectie naar het centrale zenuwstelsel (CNS). Het hier beschreven Protocol (Figuur 1A) maakt de detectie en visualisatie van rabv en rabv geïnfecteerde cellen mogelijk in grote, samenhangende beeld stapels verkregen uit geïnfecteerd hersenweefsel. Dit maakt een onbevooroordeelde, 3D hoge-resolutie beoordeling van de infectie omgeving. Het is van toepassing op hersenweefsel van een verscheidenheid van soorten, kan onmiddellijk worden uitgevoerd na fixatie of na de lange termijn opslag van monsters in Paraformaldehyde (PFA), en laat de opslag en reimaging van bevlekte en gewiste monsters voor maanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De heropleving en verdere ontwikkeling van weefsel clearing technieken in de afgelopen jaren2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Thomas C. Mettenleiter en Verena te kamp voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gesteund door het Federal Excellence Initiative van Mecklenburg-Voor-Pommeren en het Europees Sociaal Fonds (ESF) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) en een studiebeurs voor intramurale samenwerking op lyssavirussen in de Friedrich-Loeffler-Instituut (RI-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H. Neuronal cell types. Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , (2018).
- CDC. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
