Transplante de rim de rato ortotópico: uma abordagem cirúrgica nova e simplificada

Summary

O objetivo deste manuscrito e protocolo é explicar e demonstrar detalhadamente o procedimento cirúrgico do transplante renal ortotópico em ratos. Este método é simplificado para alcançar a perfusão correta do rim doador e encurtar o tempo de reperfusão usando a técnica de anastomose do manguito venoso e ureteral.

Abstract

O transplante renal oferece aumento das taxas de sobrevida e melhora da qualidade de vida para pacientes com doença renal terminal, em comparação com qualquer tipo de terapia de reposição renal. Ao longo das últimas décadas, o modelo de transplante de rim de rato tem sido utilizado para estudar os fenômenos imunológicos de rejeição e tolerância. Este modelo transformou-se uma ferramenta indispensável para testar fármacos e regimes imunomoduladores novos antes de prosseguir com os grandes estudos animais pré-clínicos caros.

Este protocolo fornece uma vista geral detalhada de como executar confiantemente a transplantação ortotópico do rim nos ratos. Este protocolo inclui três etapas distintas que aumentam a probabilidade de sucesso: perfusão do rim doador por rubor através da veia porta e o uso de um sistema de manguito para anastomose as veias renais e ureteres, diminuindo assim frio e quente tempos de isquemia. Usando esta técnica, nós alcançamos taxas de sobrevivência além de 6 meses com a creatinina sérica normal nos animais com transplantes syngeneic ou tolerantes do rim. Dependendo do objetivo do estudo, este modelo pode ser modificado por tratamentos pré ou pós-transplante para estudar a rejeição aguda, crônica, celular ou mediada por anticorpos. É um modelo animal reprodutível, confiável e econômico para estudar diferentes aspectos do transplante renal.

Introduction

Historicamente, os primeiros estudos de rejeição ao transplante foram realizados por Brent e Medawar usando transplantes de pele em roedores¹. Tornou-se logo desobstruído que a pele tem características imunológicas distintas, fazendo lhe um órgão altamente imunogênica que seja diferente na rejeição de outros órgãos contínuos vascularizado². Estudos de ratos de rejeição de transplante de órgão sólido são habitualmente limitados a transplantes de coração, fígado e rim. Embora cada um desses órgãos seja adequado para estudar rejeição, há vantagens e desvantagens para cada um deles. Os transplantes cardíacos são freqüentemente transplantados para o abdome e anastomose para a aorta e veia cava, com o coração nativo do receptor no lugar³. Isso não recria as condições clínicas, anatômicas e fisiológicas humanas. Adicionalmente, os corações são muito sensíveis à isquemia fria e têm que ser reperfundidos preferencialmente dentro de 1 h a fim poder recuperar sua função⁴. Transplantes hepáticos são geralmente considerados para ser cirurgicamente mais desafiador e sensível ao tempo para executar. Após a remoção do fígado nativo, o fígado doador tem de ser implantado e reperfundidos dentro de 30 min como os receptores não podem durar mais tempo sem um fígado funcional⁵. A artéria hepática, veia porta, e especialmente a reconstrução do ducto biliar requer habilidades cirúrgicas refinadas. Além dos desafios cirúrgicos, o fígado é conhecido por possuir Propriedades tolerogênicas e roedores e os seres humanos podem se tornar operacionalmente tolerantes^6,7,8. O rim, ao contrário dos referidos órgãos, pode ser transplantado de forma ortotópica, é conhecido por ser um órgão imunogênico com episódios de rejeição consistentes e reprodutíveis (se não imunossuprimidos), e permite tempos de isquemia fria prolongados de vários Horas. Isto faz a transplantação do rim do rato um modelo ideal para estudar a rejeição e a tolerância do allograft.

A transplantação do rim (KT) é a escolha preferida do tratamento para pacientes com doença renal da fase final. Ao longo das últimas décadas, os resultados de sobrevivência a curto prazo após a KT melhoraram dramaticamente, mas os resultados de sobrevivência a longo prazo são estagnados⁹. Os regimes imunossupressores convencionais permanecem a terapia antirejeição padrão. Entretanto, o uso crônico de terapias imunossupressoras provoca morbidade e mortalidade significativas, como nefrotoxicidade, diabetes e malignidades secundárias^10,11,12. No longo prazo, o anticorpo crônico e a rejeição celular-negociada ameaçam a sobrevivência da corrupção, com as opções terapêuticas limitadas disponíveis.

Um grande objetivo no transplante é a indução da tolerância ao transplante, a fim de obviar à necessidade de imunossupressão crônica. O modelo KT de ratos é uma ferramenta robusta para investigar o processo de rejeição imunológica e avaliar novas abordagens para a imunomodulação e tolerância ao transplante. O rato também serve como um modelo adequado para o estudo de rejeição aguda e crônica mediada por célulase anticorpos^{,13,14,15,16,17}. Este modelo cirúrgico provou ser uma ferramenta de confiança, reprodutível, e rentável para estudar vários aspectos da rejeição e da tolerância do allograft. Ele é freqüentemente usado para testar novos protocolos de indução de tolerância antes de empreender estudos caros e pesados de animais de grande porte. A realização de KT em ratos requer treinamento cirúrgico extensivo e expertise para atingir taxas de sobrevida de > 90%. Neste manuscrito e no vídeo instrucional que acompanha, nós fornecemos um esboço passo a passo para KT ortotópico no rato, como realizado com sucesso por muitos anos em nossa instituição.

Antes de iniciar qualquer procedimento, a seleção de doadores e receptores é crítica e depende da natureza do experimento. Idealmente, os doadores e os receptores devem pesar entre 220 – 260 g e ter entre 8 – 12 semanas de idade. Animais 220 g têm artérias de pequeno diâmetro, veias e ureteres, tornando a anastomose no receptor particularmente desafiador. A perda sanguínea menor pode causar o hipovolemia e conduzir à morte em animais menores. Animais mais pesados do que 260 g exibem mais gordura em torno de seus vasos, e isolamento do navio exigirá mais tempo operatório e aumentar o tempo de isquemia fria.

Protocol

Os ratos Lewis (RT11) e Dark Agouti (da) (rt1a interruptora) foram comprados de vendedores comerciais (veja a tabela de materiais). Estas tensões inteiramente MHC-incompatíveis são usadas frequentemente para estudar a rejeição renal aguda do allograft. Todos os animais foram alojados e mantidos de acordo com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde (NIH) em uma instalação específica sem patógenos na Universidade Johns Hopkins. Todos os procedimentos foram aprovados …

Representative Results

Foram realizados Transplantes renais singeneicos (n = 5) e alogénicos (n = 5). Os animais com uma transplantação syngeneic alcançaram a sobrevivência a longo prazo sem nenhum tratamento imunossupressores. Os animais que receberam um transplante alogênico sem imunossupressão rejeitaram seu enxerto e sucumbiu à insuficiência renal com sobrevida mediana de 8 dias (Figura 4a). A creatinina sérica média aumentou modestamente no grupo singeneico, enqua…

Discussion

Neste manuscrito, descrevemos o método cirúrgico para KT ortotópico em ratos em detalhes, incluindo todos os equipamentos necessários para a realização desse procedimento (Figura 5). Em 1965, Fisher e Lee publicaram o primeiro relato de KT em ratos, que se tornou o início de um excitante campo investigativo¹⁸. Desde então, muitas modificações foram introduzidas para melhorar a reprodutibilidade deste modelo. Serviu como um modelo animal eficaz para estudar f…

Materials

Buprenorphine HCL	Reckitt Benckiser Healthcare UK	NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved	Zhenbang, China		11cm Flat handle
Heparin sodium injection USP	Sagent Pharmaceuticals	NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth	Jingzhong, China	WA3010
Micro needle holder	Jingzhong, China	WA2010
Micro vessel clamps	Jingzhong, China	WA40120
Micro spring sciccor 1	ROBOZ	RS-5620
Micro spring sciccor 2	F.S.T.	91501-09
Micro spring sciccor 3	Zhenbang, China		8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506)	Astellas
Rats	Charles River & Taconic Biosciences	LEW/Crl & DA-M
Shaver	Wahl	79600-2101
Suture 4-0	Ethicon	J304H
Suture, 4-0	Ethicon	683G
Suture, 10-0	Ethicon	2820G
Syringes & Needles	BD
Thread, 8-0	Ashaway	75290
Ureteral cuff	Microlumen	160-1	Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm
Venous cuff	Intramedic BD	7441	PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm