تهجين في الموقع كروميجيني في أداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة ذات الصلة بفيروس الورم الحليمي البشري
Summary
يعتبر فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) RNA الكرومي في الموقع التهجين ليكون واحدا من المعايير الذهبية للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشط داخل الأورام. وهو يسمح بتصور التعبير فيروس الورم الحليمي البشري E6-E7 mRNA مع التعريب والتقييم شبه الكمي للإشارة.
Abstract
عدوى فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) هي عامل خطر رئيسي لنوع فرعي من سرطان الخلايا الحرشفية البلعومية (OPSCC)، الذي يميل إلى أن يكون مرتبطاً بنتيجة أفضل من مكتب خدمات الرقابة على الكحول والتبغ. يمكن أن يسمح التهجين المُهجن في الموقع (CISH) من الحمض النووي الريبي الفيروسي HPV بالتقييم شبه الكمي للنسخ الفيروسية للبروتينات الأنجينية E6 وE7 وتصور في الموقع بدقة مكانية جيدة. تسمح هذه التقنية بتشخيص عدوى نشطة مع تصور نسخ فيروس الورم الحليمي البشري في الخلايا المصابة بفيروس الورم الحليمي البشري. ومن مزايا هذه التقنية تجنب التلوث من الخلايا المصابة بفيروس الورم الحليمي البشري غير اللابذية المجاورة للورم. وعموما، فإن أداء التشخيص الجيد لها قد اعتبر أن يكون المعيار الذهبي لتحديد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. منذ E6 و E7 تفاعل البروتين الفيروسي مع البروتينات الخلية pRb و p53 إلزامية لتحويل الخلايا، فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH هو ذات الصلة وظيفيا ويعكس بشكل حاد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. هذه التقنية ذات صلة سريريا ً أيضاً لأن مستويات النسخ “المنخفضة” أو “العالية” لفيروس الورم الحليمي البشري ساعدت على تحديد مجموعتين من التكهنات بين مرضى سرطان الرأس والرقبة الإيجابيين بفيروس الورم الحليمي البشري. هنا نقدم بروتوكول لدليل فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH تنفيذها على الشرائح البارافين المضمنة في الشكلين الثابتة (FFPE) مع مجموعة تم الحصول عليها من الشركة المصنعة. بدلاً من الوحي الكروموجيني، يمكن أيضاً أن يتم تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع مع الوحي الفلورسنت (RNA FISH). ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع المناعي التقليدي.
Introduction
فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH هو أداة قوية للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة، والتي قد تكون حاسمة في الآفات الحميدة أو الخبيثة في مواقع مختلفة مثل البلعوم أو عنق الرحم. قد يساعد الكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة في تشخيص الآفة الناجمة عن فيروس الورم الحليمي البشري، وبالتالي يؤثر على علاجه وتشخيصه.
فيروس الورم الحليمي البشري هو العدوى المنقولة جنسيا الأكثر شيوعا، وأكثر من 100 الأنماط الجينية الفيروسية وقد وصفت1. ومن المعروف من الناحية التخطيطية، الأنماط الجينية المنخفضة الخطورة مثل النمطين الجينيين 6 و 11، أنها تحفز الثآليل التناسلية، وداء الورم الحليمي التنفسي المتكرر، والآفات الحميدة الأخرى، في حين أن الأنماط الجينية عالية الخطورة مثل الأنماط الجينية 16 و18 هي المسؤولة عن معظم سرطانات عنق الرحم والسرطان الشرجي وتلعب دورا في ONCOGENESIS HNSCC في نسب متغيرة كما هو الحال في البيانات الوبائية الإقليمية2.
تتوفر عدة أدوات للكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري. كما عدوى فيروس الورم الحليمي البشري عالية المخاطر يؤدي إلى التعبير عن البروتينات السرطانية الفيروسية E6 و E73، وينظر على نطاق واسع الكشف عن النسخ E6 و E7 كمعيار الذهب لتحديد عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة4. يمكن إجراء فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH على عينات FFPE التي يتم الحصول عليها بسهولة تامة من المرضى الذين يعانون من مختلف الأمراض المرتبطة بفيروس الورم الحليمي البشري. وقد تم تقييم أدائه اعلى في النيوبلج داخل الظهارة الحرشفية في عنق الرحم، وفتحه، والمهبل، وفي سرطان الخلايا الحرشفية الغازيةفي عنق الرحم، والقناة الأنجستية، والجهاز العلوي 5: يحقق حساسية أكثر من 98٪ بين فيروس الورم البلميري الحمض النووي (PCR) الحالات الإيجابية. هذا هو أفضل قليلا من p16 المناعية (93%) وفيروس الورم الحليمي البشري في التهجين في الموقع (DNA ISH: 97٪)، والتي هي أكثر شيوعا. في مجموعة أخرى من 57 مريضاً يعانون من سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) الناشئة عن منطقة الرأس والرقبة، ومنطقة الأعضاء التناسلية، والجلد، والمسالك البولية، بالمقارنة مع فيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي يش، حققت فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH حساسية أفضل (100% مقابل 88%) والتحديد (87% مقابل 74%)6.
P16 المناعية هو علامة غير مباشرة تعكس اضطراب دورة الخلية التي قد تكون سبب (ولكن ليس حصرا) من قبل عدوى فيروس الورم الحليمي البشري4،7. هذا الاختبار الفعال من حيث التكلفة يمتلك حساسية جيدة وقيمة تنبؤية سلبية ويوصى به كعلامة بديلة للعدوى بفيروس الورم الحليمي البشري عالية الخطورة في سرطان البلعوم (OPC) من قبل كلية علماء الأمراض الأمريكية (CAP) والاتحاد الدولي مكافحة السرطان (UICC)8.
على الرغم من أن هذه الورقة تركز فقط على الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري في HNSCC، فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH ذات الصلة سريريا في مختلف الظروف الأخرى التي تنطوي على عدوى فيروس الورم الحليمي البشري. على سبيل المثال، قد تحسن هذه التقنية دقة تشخيص الآفات داخل الظهارية الحرشفية منخفضة الدرجة في عنق الرحم (LSIL، المعروف سابقا باسم الورم داخل الظهارة عنق الرحم، الصف 1 [CIN1]) للحالات الغامضة مورفولوجيا9. وفيما يتعلق بـ SCC البلعوم، يسمح فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH بتحديد SCC المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري، الذي يوصف بأنه متميز عن SCC البلعوم غير المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري في الطبعة الثامنة الأخيرة من تصنيف TNM لسرطان الرأس والرقبة (الاتحاد من أجل السرطان الدولي) التحكم [UICC])10. منذ فيروس الورم الحليمي البشري ذات الصلة SCC يعرض أفضل التكهن مع بقاء أطول وتعزيز العلاج الإشعاعي وحساسية العلاج الكيميائي من فيروس الورم الحليمي البشري غير ذات الصلة SCC11،12،13، قد يؤثر الكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري إدارة المرضى14,15. إلى جانب ذلك، يمكن استخدام فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH لتشخيص سرطان الأنف متعدد الفينوتيش اتوبيس فيروس الورم الحليمي البشري مع إشارة أعلى من فيروس الورم الحليمي البشري DNA CISH16. تشير عدة تحليلات متعددة المتغيرات إلى أن الكشف عن النسخ من E6 و E7 يرتبط مع أفضل التكهن في SCC البلعوم عموما7،15،17،18 وفي مجموعة فرعية من p16 إيجابية البلعوم SCC19،20.
هنا نقدم بروتوكول لدليل فيروس الورم الحليمي البشري RNA CISH التي أجريت على الشرائح FFPE مع مجموعة تم الحصول عليها من الشركة المصنعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
HPV RNA CISH التي أجريت مع عدة شراؤها هو أداة قوية للكشف عن النسخ الفيروسية ويشير إلى عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشطة. يتم تنفيذها يدويًا، وخطوات البروتوكول سهلة المتابعة بشكل عام، والمجموعة التي تم شراؤها ملائمة. تسمح هذه التقنية بتلطيخ 19 عينة نسيجية بالإضافة إلى شريحة تحكم واحدة في آن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون قسم علم الأمراض في هوبيتال يوروبين جورج بومبيدو ونكر (لورين تشامبول، إلودي ميشيل، وجيزيل لوليل)؛ ال [هتمولوج] منصة من [برك], [هوبيتل] [إيورن] [جورج] [بومبيدوو] ([كورين] [لسفرّ]); فيرجينيا كلارك للغة يحرّر; أليكساندرا البكيان لمساهمتها.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
References
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. 암 연구학. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
