Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose
Summary
Die chromogene In-situ-Hybridisierung des humanen Papillomavirus (HPV) rna gilt als einer der Goldstandards für den aktiven Nachweis der Infektion durch das humane Papillomavirus in Tumoren. Es ermöglicht die Visualisierung der HPV E6-E7 mRNA-Expression mit Lokalisierung und semiquantitativer Auswertung seines Signals.
Abstract
Die Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) ist ein wichtiger Risikofaktor für einen Subtyp des oropharyngealen Plattenepithelkarzinoms (OPSCC), das tendenziell mit einem besseren Ergebnis als alkohol- und tabakbedingte OPSCC in Verbindung gebracht wird. Die chromogene In-situ-Hybridisierung (CISH) der HPV-viralen RNA könnte die semiquantitative Auswertung viraler Transkripte der onkogenen Proteine E6 und E7 und eine In-situ-Visualisierung mit einer guten räumlichen Auflösung ermöglichen. Diese Technik ermöglicht die Diagnose einer aktiven Infektion mit der Visualisierung der HPV-Transkription in den tumoralen HPV-infizierten Zellen. Ein Vorteil dieser Technik ist die Vermeidung von Kontaminationen durch nichtneoplastische HPV-infizierte Zellen, die an den Tumor angrenzen. Insgesamt, seine guten DiagnoseLeistungen haben es als der Goldstandard für aktive HPV-Infektion Identifizierung betrachtet. Da die virale Proteininteraktion von E6 und E7 mit den Zellproteinen pRb und p53 für die Zelltransformation obligatorisch ist, ist HPV RNA CISH funktionell relevant und reflektiert akut eine aktive onkogene HPV-Infektion. Diese Technik ist auch klinisch relevant, da “niedrige” oder “hohe” HPV-Transkriptionsspiegel zur Identifizierung von zwei Prognosegruppen unter HPV-bezogenen p16-positiven Kopf- und Halskrebspatienten beitrugen. Hier stellen wir Ihnen das Protokoll für manuelle HPV-RNA-CISH vor, das auf formalinfixierten Paraffin-embedded (FFPE)-Dias mit einem vom Hersteller erhaltenen Kit durchgeführt wird. Anstelle chromogener Offenbarung kann die RNA-In-situ-Hybridisierung auch mit fluoreszierender Offenbarung (RNA FISH) durchgeführt werden. Es kann auch mit konventioneller Immunostainierung kombiniert werden.
Introduction
HPV RNA CISH ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis einer aktiven HPV-Infektion, die sich bei gutartigen oder bösartigen Läsionen an verschiedenen Orten wie dem Oropharynx oder dem Gebärmutterhals als entscheidend erweisen kann. Der Nachweis einer aktiven HPV-Infektion kann die Diagnose einer HPV-induzierten Läsion unterstützen und dadurch ihre Behandlung und Prognose beeinflussen.
HPV ist die häufigste sexuell übertragbare Infektion, und über 100 virale Genotypen wurden beschrieben1. Schematisch sind genotyparme Genotypen wie die Genotypen 6 und 11 dafür bekannt, Genitalwarzen, rezidivierende Atmungspapillomatose und andere gutartige Läsionen zu induzieren, während Hochrisiko-Genotypen wie die Genotypen 16 und auch 18 für die meisten Gebärmutterhalskrebserkrankungen verantwortlich sind. und Analkrebs und spielen eine Rolle bei der HNSCC-Onkogenese in variablen Anteilen, wie sie in den regionalen epidemiologischen Daten2berücksichtigt werden.
Für den Nachweis von HPV-Infektionen stehen mehrere Tools zur Verfügung. Da eine HPV-Infektion mit hohem Risiko zur Expression der viralen onkogenen Proteine E6 und E73führt, wird der Nachweis von E6- und E7-Transkripten weithin als Goldstandard für die aktive HPV-Infektionsidentifikationangesehen 4. HPV RNA CISH kann an FFPE-Proben durchgeführt werden, die ganz einfach von Patienten mit verschiedenen HPV-bedingten Erkrankungen gewonnen werden können. Seine Leistung wurde bei der plattenepitheliale Neoplasie im Gebärmutterhals, im Anus und in der Vagina sowie bei invasivem Plattenepithelkarzinom im Gebärmutterhals,anus und im oberen aerodigestiven Trakt 5 bewertet: es erreicht eine Empfindlichkeit von über 98% HPV DNA-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-positive Fälle. Dies ist etwas besser als p16 Immunostaining (93%) und HPV-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH: 97%), die häufiger verwendet werden. In einer anderen Kohorte von 57 Patienten mit Plattenepithelkarzinom (SCC) aus dem Kopf- und Nackenbereich, dem Genitalbereich, der Haut und den Harnwegen erreichte HPV RNA CISH eine bessere Empfindlichkeit (100% versus 88%) Spezifität (87% versus 74%)6.
P16 Immunostaining ist ein indirekter Marker, der eine Unterbrechung des Zellzyklus widerspiegelt, die (aber nicht ausschließlich) durch hpV-Infektionen verursacht werden kann4,7. Dieser kostengünstige Test besitzt eine gute Empfindlichkeit und einen negativen Vorhersagewert und wird als Ersatzmarker für eine hochriskante HPV-Infektion bei Oropharynxkrebs (OPC) vom College of American Pathologists (CAP) und von der Union for International empfohlen. Krebsbekämpfung (UICC)8.
Obwohl sich dieses Papier ausschließlich auf den Nachweis von HPV in HNSCC konzentriert, ist HPV RNA CISH klinisch relevant unter verschiedenen anderen Bedingungen, die eine HPV-Infektion beinhalten. Zum Beispiel kann diese Technik die Genauigkeit der Diagnose von niedriggradigen plattenförmigen intraepithelialen Läsionen des Gebärmutterhalses (LSIL, früher bekannt als zervikale intraepitheliale Neoplasie, Grad 1 [CIN1]) für morphologisch mehrdeutige Fälleverbessern 9. In Bezug auf oropharyngeale SCC ermöglicht HPV RNA CISH die Identifizierung von HPV-bezogenem SCC, das in der jüngsten achten Ausgabe der TNM-Klassifikation von Kopf- und Halskrebs (der Union für internationalen Krebs) als von HPV-unabhängigem oropharyngealem SCC bezeichnet wird. Steuerung [UICC])10. Da HPV-bezogenes SCC eine bessere Prognose mit längerem Überleben und verbesserter Strahlentherapie und Chemotherapie-Empfindlichkeit aufweist als HPV-unabhängige SCC11,12,13, kann der Nachweis einer HPV-Infektion Patientenmanagement14,15. Außerdem kann HPV RNA CISH zur Diagnose von HPV-bezogenem multiphänotypischem sinonasatypischem Karzinom mit einem höheren Signal als HPV DNA CISH16verwendet werden. Mehrere multivariate Analysen deuten darauf hin, dass der Nachweis von E6- und E7-Transkripten mit einerbesseren Prognose bei oropharyngealen SCC insgesamt 7,15,17,18 und Untergruppe p16-positiver oropharyngealer SCC19,20.
Hier stellen wir Ihnen das Protokoll für manuelle HPV RNA CISH vor, das auf FFPE-Dias mit einem vom Hersteller erhaltenen Kit durchgeführt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
HPV RNA CISH, das mit einem gekauften Kit durchgeführt wird, ist ein leistungsstarkes Werkzeug für den Nachweis viraler Transkripte und weist auf eine aktive HPV-Infektion hin. Manuell ausgeführt, sind die Schritte des Protokolls insgesamt einfach zu befolgen, und das gekaufte Kit ist bequem. Diese Technik ermöglicht die Färbung von 19 histologischen Proben plus einem Steuerschlitten auf einmal, und der Test dauert etwa 8 h. Es ist wichtig, die Proben nicht zwischen den Stufen austrocknen zu lassen, sofern nicht and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Abteilung für Pathologie von Hopital Européen Georges Pompidou und Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel und Giséle Legall); die Histologie-Plattform von PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark für Sprachbearbeitung; Alexandra Elbakyan für ihren Beitrag.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
References
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. 암 연구학. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
