発色性の発色性ハイブリダイゼーションは、HPV関連の頭頸部癌診断のためのツールを提供する
Summary
ヒトパピローマウイルス(HPV)RNA発色発芽は、腫瘍内の活性ヒトパピローマウイルス感染検出のための金基準の一つであると考えられている。それはHPV E6-E7 mRNA発現の可視化を可能にし、そのシグナルの局所化および半定量的評価を可能にする。
Abstract
ヒトパピローマウイルス(HPV)感染は、アルコールおよびタバコ関連のOPSCCよりも良い結果に関連する傾向がある口腔咽頭扁平上皮癌(OPSCC)のサブタイプの主要な危険因子である。HPVウイルスRNAの発血ハイブリダイゼーション(CISH)における発色性は、発因性タンパク質E6およびE7のウイルス転写物の半定量的評価および良好な空間分解を有するその中の可視化を可能にする可能性がある。この技術は、腫瘍性HPV感染細胞におけるHPV転写の可視化による活性感染の診断を可能にする。この技術の利点は、腫瘍に隣接する非腫瘍性HPV感染細胞からの汚染の回避である。全体的に、その良好な診断性能は、アクティブなHPV感染同定のためのゴールドスタンダードであると考えられています。E6およびE7ウイルスタンパク質と細胞タンパク質pRbおよびp53との相互作用は細胞形質転換に必須であるため、HPV RNA CISHは機能的に関連し、発生性発因性HPV感染を急性的に反映する。この技術は、HPV関連のp16陽性頭頸部癌患者の間で2つの予後群の同定を助けた「低」または「高い」HPV転写レベル以来、臨床的にも関連している。ここでは、メーカーから入手したキットを使用してホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)スライドで実行される手動HPV RNA CISHのプロトコルを紹介します。発色発光の代わりに、その中のRNAは蛍光啓示(RNA FISH)で行うこともできます。また、従来の免疫染色と組み合わせてもよい。
Introduction
HPV RNA CISHは、オロファリンクスや子宮頸部などの様々な場所で良性または悪性病変で重要な可能性がある活性HPV感染の検出のための強力なツールです。活性HPV感染の検出は、HPV誘発病変の診断をサポートし、それによって、その治療および予後に影響を与える可能性がある。
HPVは最も頻繁に性感染症であり、100以上のウイルス性のゲノムが記載されている1.概略的に、遺伝子型6および11などの低リスク遺伝子型は、性器疣贅、再発性呼吸乳頭腫症、およびその他の良性病変を誘発することが知られているが、遺伝子型16および18などの高リスク遺伝子型は、ほとんどの子宮頸癌を引き起こす。と肛他癌と地域疫学データ2によって説明される可変割合でHNSCC腫瘍形成の役割を果たしています.
HPV感染の検出にはいくつかのツールが用意されています。高リスクHPV感染がウイルス発生タンパク質E6およびE73の発現につながるように、E6およびE7転写物の検出は、活性HPV感染同定4のゴールドスタンダードとして広く見られている。HPV RNA CISHは、様々なHPV関連疾患に苦しむ患者から非常に容易に得られるFFPEサンプルに対して行うことができる。その性能は、子宮頸部、肛他、膣の扁平上皮内新生物、および子宮頸部、肛他および上部空気消化管の侵襲性扁平上皮癌で評価されている:それは98%以上の感受性を達成するHPV DNAポリメラーゼ連鎖反応(PCR)陽性症例の中で。これはp16免疫染色(93%)よりもわずかに優れていますその中でHPV DNAをハイブリダイゼーション(DNA ISH:97%)、より一般的に使用されています。頭頸部領域、生殖器領域、皮膚、尿路から生じる扁平上皮癌(SCC)を有する57人の患者の別のコホートでは、HPV DNA ISHと比較して、HPV RNA CISHはより良い感受性(100%対88%)を達成した特異性(87%対74%)6.
P16免疫染色は、HPV感染4、7によって引き起こされる可能性のある細胞周期破壊を反映する間接マーカーである。この費用対効果の高いテストは、良好な感度と負の予測値を有し、米国病理学者のカレッジ(CAP)と国際連合によってオアフォリンクス癌(OPC)における高リスクHPV感染の代理マーカーとして推奨されていますがんコントロール (UICC)8.
この論文はHNSCCにおけるHPVの検出のみに焦点を当てていますが、HPV RNA CISHはHPV感染を伴う様々な他の条件において臨床的に関連しています。例えば、この技術は、形態的にあいまいな症例9に対する子宮頸部の低グレード扁平上皮病変(LSIL、以前は子宮頸部内上皮新生物として知られていた、グレード1[CIN1])の診断の精度を向上させる可能性がある。前咽頭SCCに関しては、HPV RNA CISHは、頭頸部癌のTNM分類(国際癌連合の)の最近の第8版でHPV無関係の尾咽頭SCCとは異なるとラベル付けされたHPV関連SCCの同定を可能にする。コントロール [UICC])10.HPV関連SCCは、HPV無関係のSCC11、12、13よりも長い生存と強化された放射線療法および化学療法感受性でより良い予後を示すので、HPV感染の検出は影響を与える可能性がある患者管理14、15.また、HPV RNA CISHは、HPV DNA CISH16よりも高いシグナルを持つHPV関連多発性シノキピックシノナザル癌の診断に使用することができる。いくつかの多変量分析は、E6およびE7転写物の検出が、前咽頭SCC全体の7、15、17、18およびにおけるより良い予後と相関していることを示唆している。p16陽性眼咽頭SCC19のサブグループ,20.
ここでは、製造元から入手したキットを使用してFFPEスライドで実行される手動HPV RNA CISHのプロトコルを紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
購入したキットで行われるHPV RNA CISHは、ウイルス転写物の検出のための強力なツールであり、活性HPV感染を示しています。手動で実行すると、プロトコルの手順は全体的に従いやすく、購入したキットは便利です。この技術は19の組織学的サンプルプラス1つの制御スライドの染色を可能にし、アッセイは8時間の周り続ける。特に明記されていない限り、ステップ間でサンプルを乾燥させない…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ホピタル・ユーロペーン・ジョージ・ポンピドゥーとネッカー(ローリアン・シャンボレ、エロディ・ミシェル、ジゼル・レガル)の病理学部門に感謝します。PARCCの組織学プラットフォーム、ホピタルユーロペーンジョージポンピドゥー(コリンヌ・レサフェ)言語編集のためのバージニアクラーク;アレクサンドラ・エルバキアンの貢献
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
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