Cromogénico In Situ Hybridization ss una herramienta para el diagnóstico de cáncer de cabeza y cuello relacionado con el VPH
Summary
La hibridación in situ del ARN cromogénico del virus del papiloma humano (VPH) se considera una de las normas de oro para la detección activa de la infección por el virus del papiloma humano dentro de los tumores. Permite la visualización de la expresión de ARNm del VPH E6-E7 con localización y evaluación semicuantitativa de su señal.
Abstract
La infección por el virus del papiloma humano (VPH) es un factor de riesgo importante para un subtipo de carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC), que tiende a estar asociado con un mejor resultado que el OPSCC relacionado con el alcohol y el tabaco. La hibridación in situ (CISH) cromogénica del ARN viral del VPH podría permitir la evaluación semicuantitativa de las transcripciones virales de las proteínas oncogénicas E6 y E7 y una visualización in situ con una buena resolución espacial. Esta técnica permite el diagnóstico de una infección activa con la visualización de la transcripción del VPH en las células infectadas por el VPH tumoral. Una ventaja de esta técnica es la evitación de la contaminación de las células no neoplásicas infectadas por el VPH adyacentes al tumor. En general, sus buenos rendimientos de diagnóstico han considerado que es el estándar de oro para la identificación activa de la infección por VPH. Dado que la interacción de proteínas virales E6 y E7 con las proteínas celulares pRb y p53 es obligatoria para la transformación celular, el ARN CISH del VPH es funcionalmente relevante y refleja agudamente la infección activa por VPH oncogénico. Esta técnica también es clínicamente relevante, ya que los niveles de transcripción “bajos” o “altos” del VPH ayudaron a identificar dos grupos de pronóstico entre los pacientes con cáncer de cabeza y cuello p16 relacionados con el VPH. Aquí presentamos el protocolo para el ARN HPV cISH manual realizado en diapositivas de parafina incorporada sin forcina fija (FFPE) con un kit obtenido del fabricante. En lugar de la revelación cromogénica, la hibridación in situ del ARN también se puede realizar con revelación fluorescente (RNA FISH). También se puede combinar con inmunomanchas convencionales.
Introduction
El ARN CISH del VPH es una poderosa herramienta para la detección de la infección activa por VPH, que puede resultar crucial en lesiones benignas o malignas en diversos lugares, como la orofaringe o el cuello uterino. La detección de una infección activa por VPH puede apoyar el diagnóstico de una lesión inducida por el VPH y, por lo tanto, influir en su tratamiento y pronóstico.
El VPH es la infección de transmisión sexual más frecuente, y se han descrito más de 100 genotipos virales1. Esquemáticamente, genotipos de bajo riesgo como los genotipos 6 y 11 son conocidos por inducir verrugas genitales, papilomatosis respiratoria recurrente y otras lesiones benignas, mientras que los genotipos de alto riesgo como los genotipos 16 y también 18 son responsables de la mayoría de los cánceres cervicales y los cánceres anales y desempeñan un papel en la oncogénesis delHNSCC en proporciones variables, como se explica en los datos epidemiológicos regionales 2.
Hay varias herramientas disponibles para la detección de la infección por el VPH. Como una infección por VPH de alto riesgo conduce a la expresión de proteínas oncogénicas virales E6 y E73, la detección de transcripciones E6 y E7 es ampliamente vista como el estándar de oro para la identificación activa de la infección por VPH4. El ARN CISH del VPH se puede realizar en muestras de FFPE que se obtienen con bastante facilidad de pacientes que sufren de diversas enfermedades relacionadas con el VPH. Su rendimiento ha sido evaluado en neoplasia intraepitelial escamosa en el cuello uterino, el ano y la vagina, y en elcarcinoma de células escamosas invasivas en el cuello uterino, el ano y el tracto aerodigestivo superior 5: logra una sensibilidad de más del 98% entre los casos de reacción en cadena de la polimerasa del ADN del VPH (PCR) positivos. Esto es ligeramente mejor que la inmunomancha p16 (93%) y hibridación in situ del ADN del VPH (ADN ISH: 97%), que se utilizan más comúnmente. En otra cohorte de 57 pacientes con carcinoma de células escamosas (CCS) derivados de la región de la cabeza y el cuello, la región genital, la piel y las vías urinarias, en comparación con el ADN del VPH, el ARN CISH del VPH logró una mejor sensibilidad (100% frente a 88%) y especificidad (87% frente a 74%)6.
La inmunomancha P16 es un marcador indirecto que refleja la interrupción del ciclo celular que puede ser causada (pero no exclusivamente) por la infección por VPH4,7. Esta prueba rentable posee una buena sensibilidad y un valor predictivo negativo y se recomienda como un marcador suplente de la infección por VPH de alto riesgo en el cáncer de orofaringe (OPC) por el Colegio de Patólogos Americanos (CAP) y por la Unión para la Internacional Control del Cáncer (UICC)8.
Aunque este artículo se centra únicamente en la detección del VPH en HNSCC, el ARN CISH del VPH es clínicamente relevante en otras condiciones que implican la infección por el VPH. Por ejemplo, esta técnica puede mejorar la precisión del diagnóstico de lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado del cuello uterino (LSIL, anteriormente conocida como neoplasia intraepitelial cervical, grado 1 [CIN1]) para casos morfológicamente ambiguos9. En cuanto a las CEC orofaríngeas, el ARN CISH del VPH permite la identificación de sCC relacionados con el VPH, etiquetados como distintos de las CCCc orofaríngeas no relacionadas con el VPH en la reciente octava edición de la Clasificación TNM de Cáncer de Cabeza y Cuello (de la Unión para el Cáncer Internacional Control [UICC])10. Dado que el SCC relacionado con el VPH presenta un mejor pronóstico con mayor supervivencia y mayor sensibilidad a la radioterapia y quimioterapia que el SCC11,12,13,sin vPH, la detección de la infección por VPH puede afectar gestión del paciente14,15. Además, el ARN CISH del VPH se puede utilizar para el diagnóstico de carcinoma sinonasal multifenotípico relacionado con el VPH con una señal más alta que el ADN del VPH CISH16. Varios análisis multivariados sugieren que la detección de transcripciones E6 y E7 está correlacionada con un mejor pronóstico en sCC orofaríngeo en general7,15,17,18 y en el subgrupo de p16-positivo orofaríngeo SCC19,20.
Aquí presentamos el protocolo para el ARN HPV manual CISH realizado en diapositivas FFPE con un kit obtenido del fabricante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ARN CISH del VPH realizado con un kit adquirido es una poderosa herramienta para la detección de transcripciones virales e indica una infección activa por VPH. Realizado manualmente, los pasos del protocolo son en general fáciles de seguir, y el kit comprado es conveniente. Esta técnica permite la tinción de 19 muestras histológicas más una diapositiva de control a la vez, y el ensayo dura alrededor de 8 h. Es fundamental no dejar que las muestras se sequen entre pasos a menos que se mencione lo contrario. La c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el departamento de Patología de Hopital Européen Georges Pompidou y Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel y Giséle Legall); la plataforma histológica de PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark para la edición de idiomas; Alexandra Elbakyan por su contribución.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
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