Kromogen in situ hybridisering SS et værktøj til HPV-relateret hoved-og hals kræftdiagnose
Summary
Human papillomavirus (HPV) RNA kromogen in situ hybridisering anses for at være en af guld standarderne for aktiv human papillomavirus infektion påvisning inden tumorer. Det giver mulighed for visualisering af HPV E6-E7 mRNA udtryk med lokalisering og semikvantitativ evaluering af dets signal.
Abstract
Human papillomavirus (HPV) infektion er en stor risikofaktor for en subtype af orofaryngeal planocellulært karcinom (OPSCC), som har tendens til at være forbundet med et bedre resultat end alkohol-og tobaksrelateret OPSCC. Kromogen in situ-hybridisering (CISH) af HPV-viral RNA kan tillade semikvantitativ evaluering af virale udskrifter af de onkogene proteiner E6 og E7 og en in situ-visualisering med en god rumlig opløsning. Denne teknik gør det muligt at diagnosticere en aktiv infektion med visualisering af HPV transskription i de svulst HPV-inficerede celler. En fordel ved denne teknik er undgåelse af kontaminering fra nonneoplastiske HPV-inficerede celler støder op til tumoren. Samlet, dens gode diagnose forestillinger har det anset for at være den gyldne standard for aktiv HPV-infektion identifikation. Siden E6 og E7 viral protein interaktion med celle proteiner pRb og P53 er obligatorisk for celletransformation, er HPV-RNA CISH funktionelt relevant og afspejler akut aktiv onkogenic HPV-infektion. Denne teknik er også klinisk relevant, da “lav” eller “høj” HPV-transkription niveauer hjalp identifikationen af to prognose grupper blandt HPV-relaterede P16-positive hoved-og halscancer patienter. Her præsenterer vi protokollen for manuel HPV-RNA CISH udført på formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) dias med et kit fra producenten. I stedet for kromogen åbenbaring kan RNA in situ-hybridisering også udføres med fluorescerende Åbenbaring (RNA FISH). Det kan også kombineres med konventionel immun farvning.
Introduction
HPV-RNA er et effektivt værktøj til påvisning af aktiv HPV-infektion, som kan vise sig at være afgørende for godartede eller maligne læsioner på forskellige steder såsom orofarynx eller livmoderhalsen. Påvisning af en aktiv HPV-infektion kan understøtte diagnosen af en HPV-induceret læsion og dermed påvirke dens behandling og prognose.
HPV er den hyppigste seksuelt overførte infektion, og mere end 100 virale genotyper er beskrevet1. Skematisk, lavrisiko genotyper såsom genotype 6 og 11 er kendt for at fremkalde kønsvorter, recidiverende luftvejs papillomatose og andre godartede læsioner, hvorimod højrisiko-genotyper såsom genotyper 16 og 18 er ansvarlige for de fleste livmoderhalskræft og anal kræft og spille en rolle i HNSCC oncogenesis i variable proportioner, som tegnede sig for regionale epidemiologiske data2.
Der findes flere værktøjer til påvisning af HPV-infektion. Da en højrisiko-HPV-infektion fører til ekspression af virale onkogeniske proteiner E6 og E73, er påvisning af E6 og E7 udskrifter bredt betragtet som guldstandarden for aktiv HPV-infektion identifikation4. HPV-RNA CISH kan udføres på FFPE-prøver, som ganske enkelt er fremstillet af patienter, der lider af forskellige HPV-relaterede sygdomme. Dens ydeevne er blevet evalueret i plade intraepitelial neoplasi i livmoderhalsen, anus, og vagina, og i invasive pladecellekarcinom i livmoderhalsen, anus, og den øvre aerofordøjelses kanalen5: det opnår en følsomhed på over 98% blandt HPV-DNA-polymerasekæde reaktion (PCR)-positive tilfælde. Dette er lidt bedre end P16 immun farvning (93%) og HPV-DNA in situ-hybridisering (DNA ISH: 97%), som er mere almindeligt anvendt. I en anden kohorte af 57 patienter med planocellulært karcinom (SCC) som følge af hoved-og nakkeregionen, genital regionen, huden og urinvejene, sammenlignet med HPV-DNA ISH, opnåede HPV RNA CISH bedre følsomhed (100% versus 88%) og specificitet (87% versus 74%)6.
P16 immunofarvning er en indirekte markør, der afspejler forstyrrelser i cellecyklussen, som kan være forårsaget (men ikke udelukkende) af HPV–infektion4,7. Denne omkostningseffektive test besidder en god følsomhed og en negativ prædiktiv værdi og anbefales som en surrogatmarkør for højrisiko-HPV-infektion i oropharynx cancer (OPC) af College of American patologer (CAP) og af Union for international Kræftkontrol (UICC)8.
Selvom dette papir udelukkende fokuserer på påvisning af HPV i HNSCC, er HPV-RNA klinisk relevant i forskellige andre tilstande, der involverer HPV-infektion. For eksempel, denne teknik kan forbedre nøjagtigheden af diagnosen af lav-grade planocelløse intraepiteliale læsioner i livmoderhalsen (LSIL, tidligere kendt som Cervical intraepitelial neoplasi, grad 1 [CIN1]) for morfologisk tvetydige tilfælde9. Hvad angår orofaryngeal SCC, gør HPV-RNA CISH det muligt at identificere HPV-relateret SCC, mærket som forskellig fra HPV-relateret orofaryngeal SCC i den nylige ottende udgave af TNM-klassifikationen af hoved-og hals kræft (i Unionen for international Cancer Kontrol [UICC])10. Da HPV-relaterede SCC udviser en bedre prognose med længere overlevelse og forbedret strålebehandling og kemoterapi følsomhed end HPV-relateret SCC11,12,13, kan påvisning af HPV-infektion påvirke patienthåndtering14,15. Desuden kan HPV-RNA CISH anvendes til diagnosticering af HPV-relateret multiphenotypisk sinonasalt karcinom med et højere signal end HPV-DNA CISH16. Flere multivariat analyser tyder på, at påvisning af E6 og E7 udskrifter er korreleret med en bedre prognose i orofaryngeale SCC samlet7,15,17,18 og i under gruppe af P16-positive orofaryngeale SCC19,20.
Her præsenterer vi protokollen for manuel HPV-RNA, der udføres på FFPE-slides med et sæt, der er fremstillet af producenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
HPV-RNA, der udføres med et indkøbt kit, er et effektivt værktøj til påvisning af virale udskrifter, og det indikerer aktiv HPV-infektion. Udføres manuelt, trinene i protokollen er generelt let at følge, og den købte kit er praktisk. Denne teknik gør det muligt farvning af 19 histologiske prøver plus en kontrol slide på én gang, og analysen varer omkring 8 h. Det er vigtigt ikke at lade prøverne tørre ud mellem trin, medmindre andet er nævnt. Præbehandlings betingelsen skal muligvis justeres afhængigt af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker afdelingen for patologi i Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel og Gisèle Legall); den histologiske platform PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark til sprog redigering; Alexandra Elbakyan for hendes bidrag.
Materials
| Hematoxylin solution, Gill No. 1 | Merck | GHS132 | |
| HybEZ Oven (110v) | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 321710 | |
| HybEZ slide rack | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 300104 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310018 | |
| RNAscope 2.5 HD Detection Reagents-BROWN | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322310 | This kit includes amplification reagents AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 and AMP6, and detection reagents DAB-A and DAB-B |
| RNAscope 3-Plex Negative Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320871 | DAPB |
| RNAscope 3-Plex Positive Control Probe | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 320861 | PPIB |
| RNAscope H202 & Protease Plus Reagent | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322330 | Hydrogen Peroxyde x2 and Protease Plus x 1 |
| RNAscope Probe- HPV16/18 | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 311121 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | Advanced Cell Diagnostics Inc. | 310091 | Wash Buffer 50X x4 |
References
- Lowy, D. R., Schiller, J. T. Reducing HPV-associated cancer globally. Cancer Prevention Research.(Philadelphia, PA). 5 (1), 18-23 (2012).
- Laban, S., Hoffmann, T. K. Human Papillomavirus Immunity in Oropharyngeal Cancer: Time to Change the Game?. Clinical Cancer Research. 24 (3), 505-507 (2018).
- Wiest, T., Schwarz, E., Enders, C., Flechtenmacher, C., Bosch, F. X. Involvement of intact HPV16 E6/E7 gene expression in head and neck cancers with unaltered p53 status and perturbed pRb cell cycle control. Oncogene. 21 (10), 1510-1517 (2002).
- Ndiaye, C., et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 15 (12), 1319-1331 (2014).
- Mills, A. M., Dirks, D. C., Poulter, M. D., Mills, S. E., Stoler, M. H. HR-HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization. The American Journal of Surgical Pathology. 41 (5), 607-615 (2017).
- Mendez-Pena, J. E., Sadow, P. M., Nose, V., Hoang, M. P. RNA chromogenic in situ hybridization assay with clinical automated platform is a sensitive method in detecting high-risk human papillomavirus in squamous cell carcinoma. Human Pathology. 63, 184-189 (2017).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV driven oropharyngeal cancers: Comparing p16 based algorithms with the RNAscope HPV-test. Oral Oncology. 62, 101-108 (2016).
- Lewis, J. S., et al. Human Papillomavirus Testing in Head and Neck Carcinomas: Guideline From the College of American Pathologists. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (5), 559-597 (2018).
- Mills, A. M., Coppock, J. D., Willis, B. C., Stoler, M. H. HPV E6/E7 mRNA In Situ Hybridization in the Diagnosis of Cervical Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (LSIL). The American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 192-200 (2018).
- El-Naggar, A., Chan, J. K. C., Grandis, J. R., Takata, T., Slootweg, P. J. . WHO Classification of Head and Neck Tumours. , (2017).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. The New England Journal of Medicine. 363 (1), 24-35 (2010).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. 암 연구학. 73 (1), 128-138 (2013).
- Outh-Gauer, S., et al. Immunotherapy in head and neck cancers: a new challenge for immunologists, pathologists and clinicians. Cancer Treatment Reviews. 65, 54-64 (2018).
- Mirghani, H., et al. Diagnosis of HPV-driven head and neck cancer with a single test in routine clinical practice. Modern Pathology. 28 (12), 1518-1527 (2015).
- Bishop, J. A., et al. Detection of Transcriptionally Active High-risk HPV in Patients With Head and Neck Squamous Cell Carcinoma as Visualized by a Novel E6/E7 mRNA In Situ Hybridization Method. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Hsieh, M. -. S., Lee, Y. -. H., Jin, Y. -. T., Huang, W. -. C. Strong SOX10 expression in human papillomavirus-related multiphenotypic sinonasal carcinoma: report of 6 new cases validated by high-risk human papillomavirus mRNA in situ hybridization test. Human Pathology. 82, 264-272 (2018).
- Shi, W., et al. Comparative Prognostic Value of HPV16 E6 mRNA Compared With In Situ Hybridization for Human Oropharyngeal Squamous Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 27 (36), 6213-6221 (2009).
- Kuo, K. -. T., et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma—molecular basis and predicting favorable outcome. Modern Pathology. 21 (4), 376-386 (2008).
- Augustin, J., et al. Evaluation of the efficacy of the four tests (p16 immunochemistry, PCR, DNA and RNA In situ Hybridization) to evaluate a Human Papillomavirus infection in head and neck cancers: a cohort of 348 French squamous cell carcinomas. Human Pathology. , (2018).
- Jung, A. C., et al. Biological and clinical relevance of transcriptionally active human papillomavirus (HPV) infection in oropharynx squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. 126 (8), 1882-1894 (2009).
- Augustin, J., et al. HPV RNA CISH score identifies two prognostic groups in a p16 positive oropharyngeal squamous cell carcinoma population. Modern Pathology. , (2018).
- Evans, M. F., et al. HPV E6/E7 RNA In Situ Hybridization Signal Patterns as Biomarkers of Three-Tier Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade. PLOS ONE. 9 (3), e91142 (2014).
- Dreyer, J. H., Hauck, F., Oliveira-Silva, M., Barros, M. H. M., Niedobitek, G. Detection of HPV infection in head and neck squamous cell carcinoma: a practical proposal. Virchows Archiv. 462 (4), 381-389 (2013).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. , (2017).
