Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus
Summary
Um Pan-lyssavirus Nested transcrição reversa da polimerase em cadeia foi desenvolvida para detectar especificamente todos os lissavírus conhecidos. A validação utilizando amostras cerebrais da raiva de diferentes espécies animais mostrou que este método tem sensibilidade e especificidade equivalentes ao teste padrão-ouro de anticorpos fluorescentes e pode ser utilizado para o diagnóstico rotineiro da raiva.
Abstract
Para detectar o vírus da raiva e outras espécies-membro do gênero lyssavirus dentro da família Rhabdoviridae, a reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa do Pan-lyssavirus (nested RT-PCR) foi desenvolvida para detectar a região conservada do gene do nucleoproteína (N) dos lyssavirus. O método aplica a transcrição reversa (RT) usando o RNA viral como o molde e o oligo (descolamento)15 e os hexâmeros aleatórios como primers para sintetizar o ADN complementar viral (cDNA). Em seguida, o cDNA viral é usado como um modelo para amplificar um fragmento de gene N 845 BP no PCR de primeira rodada usando primers externos, seguido de PCR Nested segundo round para amplificar o fragmento final de 371 BP usando primers internos. Este método pode detectar diferentes clados genéticos de vírus da raiva (rabv). A validação, usando 9.624 espécimes cerebrais de oito espécies animais domésticos em 10 anos de diagnósticos clínicos de raiva e vigilância na China, mostrou que o método tem 100% de sensibilidade e 99,97% de especificidade em comparação com a fluorescente direta teste de anticorpos (FAT), o método padrão-ouro recomendado pela Organização Mundial da saúde (OMS) e pela Organização Mundial para a saúde animal (OIE). Além disso, o método também poderia ampliar especificamente o fragmento de gene N alvo de 15 outras espécies de lyssavirus aprovadas e duas novas no 10º relatório do Comitê Internacional de taxonomia de vírus (ICTV), avaliada por uma detecção mímica de sintetizados N plasmídeos do gene de todos os lyssavirus. O método fornece uma alternativa conveniente ao FAT para o diagnóstico da raiva e foi aprovado como um padrão nacional (GB/T36789-2018) de China.
Introduction
A raiva é uma doença zoonótica mundial causada por vírus dentro do gênero lyssavirus1. Os lissavírus (família Rhabdoviridae) são vírus de RNA de cadeia única negativa com um genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) e a grande proteína ou polimerase (L). Baseado em seqüências do nucleotide do gene de N, distância genética, e testes padrões antigénicos, os lyssavirus foram divididos em 16 espécies, compreendendo o vírus de raiva Classical (RABV) e os vírus raiva-relacionados (RRV): vírus do bastão de Lagos (LBV), vírus de Duvenhage (DUVV ), Mokola Virus (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), Australian bat lyssavirus (ABLV), Aravan Virus (ARAV), Ikoma Virus (IKOV), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), Mónica bat lyssavirus (GBLV), Irkut Virus (IRKV), Khujand Virus (KHUV), West Caucasian bat Virus (WCBV), Shimoni bat Virus (SHIBV), e Lleida bat lyssavirus (LLEBV)2. Recentemente, foram identificados dois lissavírus adicionais: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) isolado do morcego de um Brandt (Myotis brandtii) na finlândia em 2017 e3 de Taiwan e lyssavirus morcego (twblv) isolados de um pipistrelle japonês ( Pipistrellus abramus) em Taiwan, China em 2016 – 20174.
Todos os mamíferos são suscetíveis à raiva; Entretanto, nenhuma lesão patognomônico bruta ou sinais clínicos específicos permitem sua identificação, e o diagnóstico só pode ser feito no laboratório5. O método mais utilizado para o diagnóstico da raiva é a gordura, considerada padrão-ouro tanto pela OMS quanto pela OIE5,6. Não obstante, o FAT pode produzir resultados não confiáveis em amostras degradadas/autolyzed do tecido de cérebro. Adicionalmente, não pode ser usado para ensaiar espécimes fluidos biológicos tais como o líquido cerebrospinal (CSF), a saliva, e a urina, desse modo na maior parte impedindo seu emprego no diagnóstico anterior à morte7. Os testes diagnósticos convencionais alternativos, tais como o teste da infecção da cultura do tecido da raiva (RTCIT) e o teste da inoculação do rato (MIT), exigem diversos dias6, uma desvantagem principal quando um diagnóstico rápido é essencial.
Os vários testes diagnósticos moleculars (por exemplo, a deteção do RNA viral pelo RT-PCR, o PCR-enzima-lig o ensaio da imunoabsorção [PCR-ELISA], a hibridação in situ, e o PCR tempo real) são usados como técnicas rápidas e sensíveis para o diagnóstico da raiva8. A RT-PCR é agora recomendada pela OIE para o diagnóstico rotineiro da raiva, e uma PCR heminested (HN) é descrita no manual de testes de diagnóstico e vacinas para animais terrestres da OIE para detectar todos os lissavírus5. Aqui nós descrevemos um RT-PCR aninhado do Pan-lyssavirus, que permita a deteção específica e sensível de todas as 18 espécies do lyssavirus comparáveis ou excedendo aquela obtida pelo FAT. O princípio do método é um RT do RNA alvo (região conservada do gene do lyssavirus N) no cDNA, seguido pela amplificação do cDNA por duas voltas do PCR. O cDNA sofre o PCR de primeira rodada com primers externos para amplificar um fragmento de 845 BP; Então, o segundo-redondo PCR usa o primeiro-redondo produto do PCR como um molde para amplificar um fragmento da BP 371 com primeiras demão internas. As duas rodadas de PCR aumentam significativamente a sensibilidade do ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atualmente, RABV é um Major lyssavirus responsável por quase toda a raiva humana e animal na China, bem como em outros países. Além, uma variação de IRKV foi identificada primeiramente de um bastão deleucogaster de Murina na província de Jilin em China do nordeste em 201210, e foi relatado para causar a morte de um cão na província de Liaoning em 201711. Mais recentemente, um Lyssavirus novo, TWBLV, foi identificado igualmente de um bastão japon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado pelo plano nacional de pesquisa e desenvolvimento (Grant no. 2016YFD0500401) e pela Fundação Nacional de ciência natural da China (Grant no. 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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