Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses
Summary
Se ha desarrollado una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa de pan-lyssavirus para detectar específicamente todos los lyssavirus conocidos. La validación utilizando muestras cerebrales de rabia de diferentes especies animales demostró que este método tiene una sensibilidad y especificidad equivalente a la prueba de anticuerpos fluorescentes estándar de oro y podría ser utilizado para el diagnóstico de la rabia de rutina.
Abstract
Para detectar el virus de la rabia y otras especies miembro del género lyssavirus dentro de la familia rhabdoviridae, se desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada de pan-lyssavirus (RT-PCR anidada) para detectar la región conservada del gen de la nucleoproteína (N) de los lissavirus. El método aplica la transcripción inversa (RT) utilizando ARN viral como plantilla y oligo (DT)15 y hexámeros tal aleatorios como imprimadores para sintetizar el ADN complementario viral (cDNA). Luego, el cDNA viral se utiliza como una plantilla para amplificar un fragmento de gen 845 BP N en PCR de primera ronda usando imprimadores externos, seguidos por PCR anidada de segunda ronda para amplificar el fragmento final de 371 BP usando imprimadores internos. Este método puede detectar diferentes clados genéticas de virus de la rabia (RABV). La validación, utilizando 9.624 especímenes de cerebro de ocho especies de animales domésticos en 10 años de diagnósticos clínicos de rabia y vigilancia en China, demostró que el método tiene 100% de sensibilidad y 99,97% de especificidad en comparación con la fluorescente directa prueba de anticuerpos (FAT), el método estándar de oro recomendado por la Organización Mundial de la salud (OMS) y la Organización Mundial de sanidad animal (OIE). Además, el método también podría amplificar específicamente el fragmento genético N objetivo de otras 15 especies aprobadas y dos novelas de lyssavirus en el 10º informe del Comité Internacional sobre taxonomía de virus (ICTV), evaluado por una detección mímica de N plásmidos génicos de todos los lyssaviruses. El método proporciona una alternativa conveniente a FAT para el diagnóstico de la rabia y ha sido aprobado como una norma nacional (GB/T36789-2018) de China.
Introduction
La rabia es una enfermedad zoonótica mundial causada por virus en el género lyssavirus1. Los lyssavirus (familia rhabdoviridae) son virus de ARN de cadena única negativa con un genoma de aproximadamente 12 KB que codifica cinco proteínas: N, fosfoproteína (P), proteína matricial (M), glicoproteína (G) y la proteína grande o polimerasa (L). Basándose en secuencias de nucleótidos del gen N, la distancia genética y los patrones antigénicos, los lissavirus se han dividido en 16 especies, que comprenden el virus de la rabia clásica (RABV) y los virus relacionados con la rabia (RRV): virus del murciélago de lagos (LBV), virus de Duvenhage (DUVV ), Virus Mokola (MOKV), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2), lyssavirus murciélago australiano (ABLV), virus Aravan (ARAV), virus Ikoma (IKOV), lyssavirus de murciélago Bokeloh (BBLV), lyssavirus Gannoruwa bat (GBLV), virus Irkut (IRKV), Khujand virus (KHUV), el virus del murciélago del Cáucaso occidental (WCBV), el virus del murciélago Shimoni (SHIBV), y el lyssavirus del murciélago de Lleida (LLEBV)2. Recientemente, se han identificado dos lyssavirus adicionales: Kotalahti bat lyssavirus (KBLV) aislado de un murciélago de Brandt (Myotis Brandtii) en finlandia en 20173 y lyssavirus murciélago Taiwán (twblv) aislado de un Pipistrelle japonés ( Pipistrellus abramus) en Taiwán, China en 2016 – 20174.
Todos los mamíferos son susceptibles a la rabia; sin embargo, ninguna lesión patognomónica bruta o signos clínicos específicos permiten su identificación, y el diagnóstico sólo se puede hacer en el laboratorio5. El método más ampliamente utilizado para el diagnóstico de la rabia es la grasa, que se considera como el estándar de oro por la OMS y la OIE5,6. Sin embargo, la FAT puede producir resultados poco fiables en muestras de tejido cerebral degradadas/autolizadas. Además, no se puede utilizar para el ensayo de muestras de fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva y la orina, lo que excluye en gran medida su empleo en el diagnóstico de antemortem7. Las pruebas diagnósticas convencionales alternativas, tales como la prueba de infección del cultivo del tejido de la rabia (RTCIT) y la prueba de inoculación del ratón (MIT), requieren varios días6, un inconveniente importante cuando un diagnóstico rápido es esencial.
Varias pruebas de diagnóstico molecular (p. ej., la detección de ARN viral por RT-PCR, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas PCR [PCR-ELISA], hibridación in situ y PCR en tiempo real) se utilizan como técnicas rápidas y sensibles para el diagnóstico de rabia8. La OIE recomienda ahora la RT-PCR para el diagnóstico rutinario de la rabia, y se describe una PCR heminested (HN) en el manual de pruebas diagnósticas y vacunas para animales terrestres de la OIE para detectar todos los lyssavirus5. Aquí describimos un pan-lyssavirus anidado RT-PCR, que permite la detección específica y sensible de las 18 especies de lyssavirus comparables o superiores a las obtenidas por la grasa. El principio del método es un RT del ARN Diana (región conservada del gen del lyssavirus N) en la cDNA, seguida de la amplificación de la cDNA por dos rondas de PCR. El cDNA sufre el PCR de primera ronda con imprimadores externos para amplificar un fragmento de 845 BP; a continuación, el PCR de segunda ronda utiliza el producto PCR de primera ronda como plantilla para amplificar un fragmento de 371 BP con imprimaciones internas. Las dos rondas de PCR aumentan significativamente la sensibilidad del ensayo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actualmente, RABV es un lissavirus importante responsable de casi toda la rabia humana y animal en China, así como en otros países. Además, una variante de IRKV fue identificada por primera vez a partir de un murciélago Murina leucogaster en la provincia de Jilin en el noreste de China en 201210, y se ha reportado que causó la muerte de un perro en la provincia de Liaoning en 201711. Más recientemente, un nuevo lyssavirus, TWBLV, también fue identif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por el plan nacional clave de investigación y desarrollo (Grant Nº 2016YFD0500401) y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant Nº 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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