一种通用嵌套逆转录酶链反应检测裂解病毒的评价
Summary
一种泛裂解病毒嵌套逆转录聚合酶链反应已开发出来, 专门检测所有已知的溶酶病毒。利用不同动物物种的狂犬病脑样本进行验证, 表明该方法具有与金标准荧光抗体检测相当的敏感性和特异性, 可用于常规狂犬病诊断。
Abstract
为了检测狂犬病毒和其他品种的独状病毒在Rhabdoviridae家族中, 开发了泛裂解病毒嵌套逆转录聚合酶链反应 (嵌套 rt-pcr) 来检测保守区域裂解病毒的核蛋白 (N) 基因。该方法应用逆转录酶 (RT) 作为模板, 寡核苷酸 (dT) 15 和随机六分体为引物, 合成病毒互补 DT (cdna)。然后, 病毒 cDNA 被用作模板, 在第一轮 PCR 中使用外部引物扩增 845 bpn 基因片段, 然后采用第二轮嵌套 PCR, 使用内引物扩增最终 371 bp 片段。这种方法可以检测狂犬病病毒 (RABIES) 的不同遗传障碍。该方法在中国10年的临床狂犬病诊断和监测中, 使用了8种家畜的 9, 624个大脑标本, 结果表明, 与直接荧光相比, 该方法具有100% 的敏感性和99.97 的特异性。抗体检测 (FAT), 这是世界卫生组织 (世卫组织) 和世界动物卫生组织 (OIE) 推荐的金标准方法。此外, 该方法还可以具体放大国际病毒分类委员会 (ICTV) 第十次报告中其他15个已批准的和两个新的裂解病毒物种的靶向 n 基因片段, 并通过对合成的模拟检测进行评估。所有裂解病毒的 n 基因质粒。该方法为 FAT 狂犬病诊断提供了一种方便的替代方法, 并已被批准为中国国家标准 (GB/T36789-2018)。
Introduction
狂犬病是一种世界性的人畜共患疾病,由 Lyssavirus1属内的病毒引起。Lyssaviruses ( Rhabdoviridae家族) 是单基因链 rna 病毒, 基因组约为 12 kb, 编码五种蛋白质: n、磷蛋白 (p)、基质蛋白 (m)、糖蛋白 (g) 和大蛋白质或聚合酶 (l)。根据 N 基因的核苷酸序列、遗传距离和抗原模式, lyssaviruses 被划分为16个物种, 包括经典狂犬病病毒 (RABIES) 和狂犬病相关病毒 (RRV): 拉各斯蝙蝠病毒 (LBV)、Duvenhage 病毒 (DUVV))、Ikoma 病毒 (IKOMA)、欧洲蝙蝠裂解病毒 1 (EBLV-1)、欧洲蝙蝠裂解病毒 2 (EBLV-2)、澳大利亚蝙蝠裂解病毒 (ABLV)、Aravan 病毒 (ARAV)、Ikoma 病毒 (IKOV)、Bokeloh 蝙蝠 lyssavirus (BBLV)、Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV)、Ikoma 病毒 (IKOMA),Khujand 病毒 (KHUV)、西亚蝙蝠病毒 (WCBV)、Shimoni 蝙蝠病毒 (SHIBV) 和 Lleida 蝙蝠裂解病毒 (LYSSAVIRUS)2。最近又发现了两种溶酶病毒: 2017年在芬兰从勃兰特蝙蝠 (Myotis brandtii) 中分离出的 kotalahti 蝙蝠溶酶病毒 (kblv) 3 和从日本管状物中分离出的台湾蝙蝠溶酶病毒 (twblv) (2016年至2017年在中国台湾的 pipistrellus abramus) 4。
所有哺乳动物都容易患狂犬病;然而, 没有严重的病原学病变或特定的临床体征允许其识别, 诊断只能在实验室5。狂犬病诊断最广泛使用的方法是 fat, 世卫组织和国际兽疫局5、6、6都将其视为金本位。然而, FAT 可以产生不可靠的结果降解/自溶脑组织样本。此外, 它不能用于检测生物液体标本, 如脑脊液 (CSF), 唾液和尿液, 从而在很大程度上排除了它在前肿瘤诊断7。替代常规诊断测试, 如狂犬病组织培养感染测试 (RTCIT) 和小鼠接种测试 (MIT), 需要几天6, 一个主要的缺点, 当快速诊断是必不可少的。
各种分子诊断测试 (例如, 通过 RT-PCR 检测病毒 rna、PCR-酶联免疫吸附法 [PCR-ELISA]、原位杂交和实时 PCR) 被用作狂犬病诊断的快速和敏感技术8。RT-PCR 现在被国际兽疫局推荐用于常规狂犬病诊断, 并且在《兽生动物诊断测试和疫苗手册》中描述了一种半检测 (hn) PCR, 以检测所有的溶酶病毒 5。在这里, 我们描述了一个泛裂解病毒嵌套的 RT-PCR, 它允许特定和敏感地检测所有18种裂解病毒, 类似于或超过 FAT 获得的。该方法的原理是将目标 RNA (裂解病毒 N 基因的保守区域) rt 转化为 cDNA, 然后通过两轮 PCR 扩增 cdna。CDNA 通过第一轮 PCR 与外部引物, 以扩增 845 bp 片段;然后, 第二轮 PCR 使用第一轮 PCR 产物作为模板, 用内引物扩增 371 bp 片段。两轮 PCR 显著提高了检测的灵敏度。
Protocol
Representative Results
Discussion
目前, RABIES 是一种主要的裂解病毒, 对中国以及其他国家几乎所有的人类和动物狂犬病负有责任。此外, 2012年10年, 在中国东北吉林省的murina 白球蝙蝠身上首次发现了 irkv 变种, 据报道, 该变种在2017年在辽宁省造成一只狗死亡11。最近, 2017年, 在中国台湾, 从日本的一种管状蝙蝠身上发现了一种新型的溶酶病毒 TWBLV。这些结果表明, 有效检测其他裂解?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家关键研究和发展计划 (2016号 YFD0500401 赠款) 和中国国家自然科学基金 (第31302043赠款) 的支持。
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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