הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses
Summary
פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.
Abstract
כדי לזהות וירוס כלבת ומינים אחרים של הסוג Lyssavirus בתוך המשפחה התמס שריר, הפאן-lyssavirus מקונן הפוך תגובת שרשרת פולימראז (מקונן RT-PCR) פותחה כדי לזהות את האזור שימור של הגנים הנואופלפרוטאין (N) של ליסביזירוסים. השיטה מחילה הפוכה שעתוק (RT) באמצעות RNA ויראלי כמו תבנית ו oligo (dT)15 ו הבוחנים אקראיים כמו התחל לסנתז את ה-DNA המשלים ויראלי (cdna). לאחר מכן, cDNA ויראלי משמש תבנית כדי להגביר 845 bp N מקטע גנים בסיבוב הראשון של ה-PCR באמצעות התחל החיצוני, ואחריו ה-PCR מקונן השני להגביר את הסופי 371 bp קטע באמצעות התחל הפנימי. שיטה זו יכולה לזהות שיטות גנטיות שונות של וירוסי כלבת (RABV). האימות, שימוש 9,624 דגימות מוח של שמונה מינים בעלי חיים ביתיים ב 10 שנים של אבחון כלבת קלינית ומעקב בסין, הראו כי השיטה יש 100% רגישות ו 99.97% ספציפיות בהשוואה עם פלורסנט ישירה מבחן נוגדן (FAT), השיטה הסטנדרטית זהב המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמי (מי) והארגון העולמי לבריאות בעלי חיים (OIE). בנוסף, השיטה יכולה במיוחד להגביר את המוקד המיועד N גן של 15 מאושרים אחרים ושני מינים lyssavirus הרומן בדוח 10 של הוועד הבינלאומי על טקסונומיה של וירוסים (ICTV) כפי שוערך על ידי זיהוי חיקוי של מסונתז . גן הפלזמה של כל הנגיפים השיטה מספקת חלופה נוחה ל-FAT עבור אבחון כלבת ואושרה כסטנדרט לאומי (GB/T36789-2018) של סין.
Introduction
כלבת היא מחלה zoonotic עולמית הנגרמת על ידי וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus1. Lyssaviruses (משפחה תמסשליליות) הם חד שליליים וירוסי RNA עם הגנום כ 12 kb המקודד חמישה חלבונים: N, פוספופפרוטאין (P), חלבון מטריצה (M), גליקופרוטאין (G), וחלבון גדול או פולימראז (L). מבוסס על רצפי נוקלאוטיד של N הגן, המרחק הגנטי, ודפוסי אנטיגניים, lyssaviruses חולקו 16 מינים, המורכב וירוס כלבת הקלאסי (RABV) ואת הקשורים לכלבת וירוסים (RRV): לאגוס וירוס בת (LBV), וירוס Duvenhage (DUVV ), וירוס מוקדי (מוקדי), העטלף האירופי lyssavirus 1 (EBLV-1), העטלף האירופי lyssavirus 2 (EBLV-2), העטלף האוסטרלי lyssavirus (ABLV), וירוס (ARAV), וירוס Ikoma (IKOV), Bokeloh בת lyssavirus (BBLV), בובת ליסביו וירוס (GBLV), Irkut וירוס (IRKUT), קוג’וירוס (ח’ו), וירוס עטלף קווקזי מערבי (WCBV), וירוס שמעוני בת (שימב), וליידה בת ליסביסוירוס (לואלין)2. לאחרונה, שתי lyssaviruses נוספים זוהו: Kotalahti בת lyssaviruses (KBLV) בודד מן העטלף של ברנדט (Myotisברנטי) בפינלנד ב 20173 ו-lyssaviruses ירוס בת טייוואן (twblv) מבודד pipistrellllllllllllllll Pipistrellus abramus) בטייוואן, סין בשנת 2016 – 20174.
כל היונקים רגישים לכלבת; עם זאת, לא נגעים פתוגנוניים ברוטו או שלטים קליניים ספציפיים לאפשר זיהוי שלה, ואבחון יכול להתבצע רק במעבדה5. השיטה הנפוצה ביותר לאבחון כלבת היא השומן, שנחשב לסטנדרט הזהב של האדם והשני, שניהם5,6. אף על פי כן, השומן יכול לייצר תוצאות לא מהימנות על בדיקות רקמה במוח בירידה/אוטומטית. בנוסף, לא ניתן להשתמש בו כדי לאבחן דגימות נוזלים ביולוגיים כגון נוזל שדרתי (שדרתי), רוק ושתן, ובכך מנעה במידה רבה את התעסוקה שלו באבחון הנתיחה7. בדיקות האבחון הקונבנציונליות המקובלות, כגון בדיקת הזיהום בתרבות רקמת הכלבת (RTCIT) ובדיקת החיסון לעכבר (MIT), דורשות מספר ימים6, חיסרון גדול כאשר אבחון מהיר חיוני.
בדיקות אבחון מולקולריות שונות (לדוגמה, זיהוי רנ א ויראלי על-ידי RT-PCR, התפקוד החיסוני המקושר ל-pcr, בתוך היברידיזציה, ו-PCR בזמן אמת) משמשים כטכניקות מהירות ורגישות לאבחון כלבת8. RT-PCR מומלץ כיום על ידי OIE עבור אבחון כלבת שגרתית, ו המופילו (ח נ) PCR מתואר במדריך OIE של בדיקות אבחון וחיסונים עבור חיות יבשתי כדי לזהות את כל lyssaviruses5. כאן אנו מתארים הפאן-lyssavirus מקונן RT-PCR, אשר מאפשר זיהוי ספציפי ורגיש של כל 18 lyssavirus מינים להשוות או לחרוג שהושג על ידי השומן. העיקרון של השיטה הוא RT של RNA היעד (אזור שימור של גן lyssavirus N) לתוך cDNA, ואחריו הגברה של cDNA על ידי שני סיבובים של ה-PCR. CDNA עובר את ה-PCR העגול הראשון עם התחל החיצוני כדי להגביר רסיס bp 845; לאחר מכן, ה-PCR העגול השני משתמש במוצר ה-PCR העגול הראשון כתבנית כדי להגביר רסיס של 371 bp עם התחל הפנימי. שני סיבובים של ה-PCR מגבירים באופן משמעותי את רגישות הצורה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כיום, RABV הוא וירוס מרכזי האחראי על כמעט כל כלבת האדם והחיה בסין, כמו גם במדינות אחרות. בנוסף, משתנה IRKV זוהה לראשונה מ- Murina leucogaster במחוז ג’ילין בצפון מזרח סין ב 201210, והיא דווחה כדי לגרום למותו של כלב במחוז ליאונינג ב 201711. לאחרונה, הרומן lyssavirus, TWBLV, זוהה גם מתוך ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר היה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי (גרנט no. 2016YFD0500401) ואת הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט no. 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
