تكنولوجيا كريسبر/كاس9 في استعادة التعبير عن عسر الهضم في مُدَجّن العضلات المشتقة من iPSC
Summary
هنا، نقدم بروتوكول حذف exon23 المستندة إلى Cas9 لاستعادة التعبير dystrophin في iPSC من DMDmdx الخلايا الليفية الجلدية المشتقة من الماوس وتميز مباشرة iPSCs في خلايا ذرية myogenic (MPC) باستخدام نظام تنشيط تيت أون MyoD.
Abstract
ضمور العضلات دوشين (DMD) هو مرض العضلات التدريجي الحاد الناجم عن الطفرات في جين dystrophin، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى استنفاد خلايا ذرية العضلات. تجميعها بانتظام بين متباعدة قصيرة تكرار باليندروميك / كريسبر المرتبطة 9 (CRISPR / Cas9) تحرير الجينات لديه القدرة على استعادة التعبير عن جين dystrophin. يمكن للخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة ذاتيًا (iPSCs) التي تستمد خلايا العضلات (MPC) تجديد تجمع الخلايا الجذعية/السلفية وإصلاح الأضرار ومنع حدوث المزيد من المضاعفات في DMD دون التسبب في استجابة مناعية. في هذه الدراسة، نقدم مزيج من كريسبر / كاس9 والتكنولوجيات iPSC غير المتكاملة للحصول على الذرية العضلات مع التعبير البروتين dystrophin تعافى. باختصار، نستخدم متجه Sendai غير متكامل لإنشاء خط iPSC من الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانMdx DMD. ثم نستخدم استراتيجية الحذف CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير dystrophin من خلال نهاية غير متجانسة الانضمام إلى الجين dystrophin إعادة صياغة. بعد التحقق من استنفاد exon23 exon23 في ثلاث مستعمرات من 94 المستعمرات التي تم اختيارها iPSC، ونحن نميز iPSC في MPC عن طريق doxycycline (دوكس) التي يسببها التعبير MyoD، وهو عامل النسخ الرئيسي يلعب دورا هاما في تنظيم تمايز العضلات. تظهر نتائجنا جدوى استخدام استراتيجية حذف CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير عن عسر التحجر في MPC المشتقة من iPSC، والتي لديها إمكانات كبيرة لتطوير العلاجات المستقبلية لعلاج DMD.
Introduction
ضمور العضلات دوشين (DMD) هو واحد من الضمور العضلي الأكثر شيوعا ويتميز بعدم وجود dystrophin، مما يؤثر على 1 من حوالي 5000 الأولاد حديثي الولادة في جميع أنحاء العالم1. فقدان وظيفة الجينات dystrophin يؤدي إلى عيوب العضلات الهيكلية مما يؤدي إلى انحطاط myofibers التدريجي1,2. وقد تم اختبار فيروس المؤتلف المرتبطة بأدينو (rAAV) بوساطة نظام العلاج الجيني لاستعادة التعبير dystrophin وتحسين وظيفة العضلات، مثل استبدال الجينات باستخدام خلل التوتر الجزئي (μ-Dys). ومع ذلك، فإن نهج rAAV يتطلب حقن متكررة للحفاظ على التعبير عن البروتين الوظيفي3،4. لذلك، نحن بحاجة إلى استراتيجية التي يمكن أن توفر بشكل فعال ودائم استرداد التعبير الجيني dystrophin في المرضى الذين يعانون من DMD. الماوسDMD MDX، نموذج الماوس لDMD، لديه طفرة نقطة في exon 23 من الجينات dystrophin الذي يقدم codon إنهاء سابق لأوانه والنتائج في البروتين المقتطعة غير وظيفية تفتقر إلى C-محطة dystroglycan نطاق ملزم. أظهرت الدراسات الحديثة استخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9 لاستعادة التعبير الجيني dystrophin عن طريق تصحيح الجينات بدقة أو حذف الطارد اتّصال في الحيوانات الصغيرة والكبيرة5و6و7. أبلغ Long et al.8 عن طريقة تصحيح طفرة الجينات dystrophin في خط الجراثيم الماوس DMDMDX عن طريق إصلاح الموجهة من قبل علم الهولوجي (HDR) القائم على كريسبر / Cas9 تحرير الجينوم. وأفاد الرفاعي وآخرونأن rAAV يمكن أن يقتطع بكفاءة exon 23 متحولة في الفئران عسر التغذية. في هذه الدراسات، تم تصميم gRNAs في الإنترونات 20 و 23 للتسبب في فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مرتين، والتي استعادت جزئيا التعبير dystrophin بعد إصلاح الحمض النووي عن طريق نهاية غير متجانسة الانضمام (NHEJ). حتى أكثر إثارة, Amoasii وآخرون10 ذكرت مؤخرا فعالية وجدوى rAAV بوساطة كريسبر تحرير الجينات في استعادة التعبير dystrophin في نماذج الكلاب, خطوة أساسية في التطبيق السريري في المستقبل.
DMD يسبب أيضا اضطرابات الخلايا الجذعية11. لتلف العضلات, الخلايا الجذعية العضلات السكنية تجديد خلايا العضلات الموت بعد تمايز العضلات. ومع ذلك، فإن دورات متتالية من الإصابة والإصلاح يؤدي إلى تقصير التيلوميرات في الخلايا الجذعية العضلات12، واستنفاد سابق لأوانه لتجمعات الخلايا الجذعية13،14. ولذلك، يمكن أن يكون مزيج من العلاج بالخلايا الجذعية الذاتية مع تحرير الجينوم لاستعادة التعبير dystrophin نهجا عمليا لعلاج DMD. توفر تقنية CRISPR/Cas9 إمكانية توليد الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC) التي تم تصحيحها وراثياً من أجل تجديد العضلات الوظيفي ومنع حدوث المزيد من المضاعفات في DMD دون التسبب في رفض المناعة. ومع ذلك، iPSCs لديها خطر تشكيل الورم، والتي يمكن تخفيفها من خلال تمايز iPSC في خلايا ذرية myogenic.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف استخدام فيروس Sendai غير دمج لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية من الفئرانMdx DMD في iPSCs ومن ثم استعادة التعبير dystrophin عن طريق حذف الجينوم CRISPR /Cas9. بعد التحقق من حذف Exon23 في iPSC عن طريق علم الوراثة، قمنا بتمييز iPSC المصوبة الجينومية في الذرية الميجينية (MPC) عن طريق التمايز الماجينية المستحثة من قبل MyoD.
Protocol
Representative Results
Discussion
ضمور العضلات دوشين (DMD) هو مرض وراثي مدمر وقاتل في نهاية المطاف يتميز بعدم وجود dystrophin، مما يؤدي إلى ضمور العضلات التدريجي1،2. تظهر نتائجنا التعبير الجيني المزيل المنتم في خلايا السلالة الماجينية المستمدة من DMDmdx iPSC من خلال نهج حذف exon23 من CRISPR/Cas9-بوساطة. ول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم تانغ ووينتروب جزئيا من قبل NIH-AR070029، NIH-HL086555، NIH-HL134354.
Materials
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 | |
References
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
- Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
- Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
- Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
- Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
- Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
- Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).
