Summary

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.

Abstract

בתהליך ההתפתחותי, עוברים מייצגים יכולת יוצאת דופן להתאים את דפוס הגוף שלהם לגודל גופם; פרופורציה הגוף שלהם נשמרת גם בעוברים גדולים או קטנים יותר, בגבולות מסוימים. למרות שתופעה זו של שינוי קנה מידה משכה תשומת לב במשך יותר ממאה שנה, הבנת המנגנונים הבסיסיים הוגבלה, בשל היעדר תיאור כמותי של הדינמיקה ההתפתחותית בעוברים בגדלים מגוונים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו טכניקה חדשה בניתוח להפחית את הגודל של עוברי הדגים, אשר יש יתרונות גדולים עבור vivo live הדמיה. אנו מדגימים כי לאחר ההסרה מאוזנת של תאים וחלמון בשלב blastula בשלבים נפרדים, העוברים יכולים במהירות להתאושש תחת התנאים הנכונים ולהתפתח קטן יותר אך בדרך כלל נורמלי העוברים. מאחר שטכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד, היא ניתנת להתאמה בקלות, וניתן להשתמש בה כדי ללמוד מגוון רחב של בעיות בקנה מידה, כולל החוסן של בתיווך מורפוגן.

Introduction

מדענים ידועים זמן רב כי עוברים יש יכולת יוצאת דופן ליצור פרופורציות גוף קבוע למרות גודל העובר יכול להשתנות במידה רבה בתנאים טבעיים וניסיוניים1,2,3. למרות עשורים של מחקרים תיאורטיים וניסיוניים, החוסן הזה לשינוי גודל, נקרא שינוי קנה מידה, והמנגנונים הבסיסיים שלהם נשארים בלתי ידועים ברקמות ובאיברים רבים. על מנת ללכוד באופן ישיר את הדינמיקה של המערכת המתפתחת, הקמנו טכניקה הפחתת גודל פשוט של הפחתה ב-דג זברה4, אשר יש את היתרון הגדול ב vivo live הדמיה5.

זברפיש שימש כבעל חוליות מודל לחקר דיסציפלינות מרובות של ביולוגיה, כולל ביולוגיה התפתחותית. בפרט, דג דג זברה הוא אידיאלי עבור vivo live הדמיה6 כי 1) הפיתוח יכול להמשיך בדרך כלל מחוץ לאם ואת קליפת הביצה, ו 2) העוברים שקופים. בנוסף, העוברים יכולים לעמוד בטמפרטורה ובתנודות סביבתיות, המאפשרים להם ללמוד בתנאי מעבדה. כמו כן, בנוסף הביטוי הגן הקונבנציונלי הפרטורציה על ידי הזרקת גוורסטינו ו mrna הזרקה7,8, ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית crispr/Cas9 עשה גנטיקה הפוכה ב-דג זברה יעיל מאוד9. יתר על כן, טכניקות קלאסיות רבות ב אמבריולוגיה, כגון השתלת תאים או ניתוח רקמות ניתן להחיל4,10,11.

הפחתת גודל טכניקות פותחו במקור בעלי חיים שאינם בעלי חוליות12. לדוגמה, ב- xenopus זריזה, עוד מודל פופולרי בעלי חוליות בעלי החיים, החצייה לאורך ציר החי-ווגטל בשלב blastula, יכולים לייצר עוברים מופחתים בגודל12,13. עם זאת, בידינו זו גישה צעד אחד תוצאות העוברים מאואמים או מונאמים ב-zebrafish, ככל הנראה משום שהדטרמיניזם הדו מופץ ללא שינוי ואין לדעת את הלוקליזציה שלהם מתוך המבנה של העוברים. כאן אנו להדגים טכניקה חלופית דו-שלבים לחיתוך באמצעות הדגים המייצרת בדרך כלל אך עוברים קטנים יותר. עם טכניקה זו, תאים מוסרים לראשונה מן הקוטב חיה, אזור של תאים תמימים חסר פעילות ארגונית. כדי לאזן את כמות החלמון והתאים, שהוא חשוב עבור epiboly והבאים מורפוגנזה, חלמון מוסר לאחר מכן. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול זה ולספק שתי דוגמאות של קבוע גודל במבנה תבנית; היווצרות הצינור העצבי הגחון. בשילוב עם הדמיה כמותית, אנו משתמשים בטכניקת הפחתת גודל כדי לבחון את האופן שבו גדלים של שפופרת העצבים והצינורית העצבית מושפעים מהעוברים מופחתים בגודל.

Protocol

כל ההליכים הקשורים לדג בוצעו באישור של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) בבית הספר לרפואה של הרווארד. 1. הכנה לכלי ומגיב לעשות לולאת חוט לקצוץ עוברים קח 20 ס מ של חוט נירוסטה נוקשה ולא מאכל עם קוטר של 40 μm. לולאה התיל דרך לתוך נימי זכוכית (1.0 מ”מ ק…

Representative Results

הפחתת נפח חלמון חשוב עבור מורפולוגיה נורמליתכפי שמתואר לאחרונה באלמואדו-קסטיליו ואח ‘.17, הפחתת גודל העוברים יכולה להיות מושגת ללא צמצום נפח החלמון. כדי להשוות עם וללא הפחתת נפח החלמון, בוצעו שני שלבים חיתוך (הן blastula וחלמון) ו blastula בלבד חיתוך (איור 2 ו …

Discussion

היסטורית, בין בעלי חוליות, הפחתת גודל מבוצעת בעיקר באמצעות עוברי אמפיבי, על ידי ביצוע העוברים לאורך ציר החי-צמחי בשלב blastula12. עם זאת, ישנם בעיקר שני הבדלים בין הצפרדע לעוברים עוברי דגים כאשר אנו ביסעי עוברים. ראשון, על הבמה כאשר העוברים משתדגים להיות סובלני של בי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה נתמכת על ידי תוכנית מפרסטו של יפן מדעי וטכנולוגיה הסוכנות (JPMJPR11AA) ומכונים לאומיים של מענק בריאות (R01GM107733).

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

Play Video

Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

View Video