تخفيض حجم العمليات الجراحية لدراسة قياس النمط الجنيني
Summary
هنا ، نقوم بوصف طريقه للحد من حجم الاجنه الزبرده دون تعطيل العمليات التنموية الطبيعية. تمكن هذه التقنية من دراسة قياس النمط ومتانة النمو ضد تغيير الحجم.
Abstract
في العملية التنموية ، تظهر الاجنه قدره رائعه علي مطابقه نمط أجسامهم مع حجم أجسامهم. يتم الحفاظ علي نسبه الجسم حتى في الاجنه التي هي أكبر أو أصغر ، في حدود معينه. وعلي الرغم من ان ظاهره التحجيم هذه قد اجتذبت الاهتمام لأكثر من قرن ، فان فهم أليات الاساسيه كان محدودا ، ويعزي ذلك جزئيا إلى عدم وجود وصف كمي لديناميات النمو في الاجنه ذات الاحجام المختلفة. للتغلب علي هذا القيد ، قمنا بتطوير تقنيه جديده للحد جراحيا من حجم الاجنه الزكية ، والتي لها مزايا كبيره للتصوير الحي في الجسم. ونحن نثبت انه بعد الازاله المتوازنة للخلايا والصفار في مرحله الخلايا البدائية في خطوات منفصلة ، يمكن للجنين ان يتعافى بسرعة في ظل الظروف المناسبة ويتطور إلى أجنه أصغر حجما ولكنها طبيعيه. وبما ان هذه التقنية لا تتطلب معدات خاصه ، فانها قابله للتكيف بسهوله ، ويمكن استخدامها لدراسة مجموعه واسعه من مشاكل التحجيم ، بما في ذلك متانة الزخرفة بوساطة مورفجين.
Introduction
وقد عرف العلماء منذ فتره طويلة ان الاجنه لديها قدره ملحوظة علي تشكيل نسب الجسم ثابته علي الرغم من ان حجم الجنين يمكن ان تختلف اختلافا كبيرا في ظل الظروف الطبيعية والتجريبية1,2,3. وعلي الرغم من عقود من الدراسات النظرية والتجريبية ، فان هذا المتانة لتغيير الحجم ، الذي يطلق عليه التحجيم ، وألياته الاساسيه لا تزال غير معروفه في العديد من الانسجه والأعضاء. من أجل التقاط مباشره ديناميات النظام النامية ، انشانا تقنيه الحد من حجم استنساخه وبسيطه في الزرد4، والتي لديها ميزه كبيره في الحية في التصوير5.
وقد عملت zebrafish كنموذج فقاري الحيوانية لدراسة تخصصات متعددة من علم الاحياء ، بما في ذلك البيولوجيا التنموية. علي وجه الخصوص ، الزرد مثاليه لفي الجسم الحية التصوير6 لان 1) يمكن المضي قدما في التنمية عاده خارج الام وقذيفة البيض ، و 2) الاجنه شفافة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تحمل الاجنه بعض درجات الحرارة والتقلبات البيئية ، والتي تسمح لهم بالدراسة في الظروف المختبرية. أيضا ، بالاضافه إلى التقليدية الجينات التعبير عن الاضطراب من قبل مورفينو والحقن mrna7،8، التطورات الاخيره في تقنيه crispr/كاس 9 جعلت الوراثة العكسية في الزرد كفاءه عاليه9. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق العديد من التقنيات الكلاسيكية في علم الاجنه ، مثل زرع الخلايا أو جراحه الانسجه4،10،11.
تم تطوير تقنيات الحد من حجم في الأصل في البرمائيات وغيرها من الكائنات غير فقاري12. علي سبيل المثال ، في xenopus لفيس، نموذج آخر فقاري الحيوانية الشعبية ، والميل علي طول محور الحيوانية النباتية في مرحله البدائية يمكن ان تنتج حجم الاجنه المخفضة12،13. ومع ذلك ، في ايدينا يؤدي هذا النهج خطوه واحده في الاجنه البطنية أو البطينية في zebrafish ، من المفترض لان المحددات الظهرية موزعه بشكل غير متساو ولا يمكن للمرء ان يعرف توطينها من المورفولوجية من الاجنه. هنا نظهر تقنيه تقطيع بديله من خطوتين للزبرافين التي تنتج عاده الاجنه النامية ولكن أصغر. مع هذه التقنية ، يتم أزاله الخلايا أولا من قطب الحيوانية ، وهي منطقه من الخلايا الساذجة التي تفتقر إلى نشاط المنظم. لتحقيق التوازن بين كميه صفار البيض والخلايا ، وهو أمر مهم ل epiboly واللاحقة النشاه ، ثم يتم أزاله صفار البيض. هنا ، ونحن بالتفصيل هذا البروتوكول وتقديم مثالين من الثوابت حجم في تشكيل نمط ؛ الجسيده تشكيل والبطنية أنبوب العصبية زخرفه. الاضافه إلى التصوير الكمي ، استخدمنا تقنيه تخفيض الحجم لدراسة كيفيه تاثر احجام الأنابيب العصبية والعصبية في حجم الاجنه المخفضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تاريخيا ، من بين الفقاري الحيوانية ، تم اجراء تخفيض الحجم بشكل رئيسي باستخدام الاجنه البرمائية ، عن طريق إخراج الاجنه علي طول المحور النباتي للحيوانات في المرحلة البدائية12. ومع ذلك ، هناك أساسا اثنين من الاختلافات بين الاجنه الضفدع والزبرافيش عندما كنا شطر ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل برنامج الوكالة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا (JPMJPR11AA) والمعهد الوطني للمنح الصحية (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
