斑马鱼手术尺寸缩小术中胚胎形态缩放的研究
Summary
在这里, 我们描述了一种在不破坏正常发育过程的情况下减小斑马鱼胚胎大小的方法。这种技术可以研究模式缩放和针对大小变化的开发鲁棒性。
Abstract
在发育过程中, 胚胎表现出显著的能力, 使他们的身体模式与他们的身体大小相匹配;即使在较大或较小的胚胎中, 它们的身体比例也保持在一定范围内。虽然这种规模现象在一个多世纪以来引起了人们的注意, 但对其基本机制的了解有限, 部分原因是缺乏对不同大小胚胎发育动态的定量描述。为了克服这一限制, 我们开发了一种新的技术, 通过手术缩小斑马鱼胚胎的大小, 这对活体成像有很大的优势。我们证明, 在囊胚阶段分别平衡切除细胞和蛋黄后, 胚胎可以在合适的条件下迅速恢复, 发育成较小但原本正常的胚胎。由于这种技术不需要特殊的设备, 它很容易适应, 并可用于研究广泛的缩放问题, 包括形态原介导的模式的鲁棒性。
Introduction
科学家们早就知道, 胚胎有一个显着的能力, 形成恒定的身体比例, 虽然胚胎大小可以很大的差异, 在自然和实验条件下1, 2,3。尽管几十年的理论和实验研究, 这种鲁棒性的大小变化, 称为缩放, 其潜在的机制仍然是未知的许多组织和器官。为了直接捕捉开发系统的动力学, 我们在斑马鱼4中建立了一种可重复、简单的尺寸缩小技术, 在活体成像5中具有很大的优势。
斑马鱼曾作为脊椎动物的模型, 研究生物学的多个学科, 包括发育生物学。特别是, 斑马鱼是体内活体成像的理想选择,因为 1) 发育可以在母亲和蛋壳之外正常进行, 2) 胚胎是透明的。此外, 胚胎还能承受一定的温度和环境波动, 从而能够在实验室条件下进行研究。此外, 除了常规基因表达摄动的吗啡和 mrna 注射7,8, 最近的进展 crispr/cas9 技术使反向遗传学在斑马鱼高效9。此外, 胚胎学中的许多经典技术, 如细胞移植或组织手术, 可以应用4,10,11。
减少大小的技术最初是在两栖动物和其他非脊椎动物中开发的.例如, 在另一种流行的脊椎动物模型月子劳维斯, 在囊胚阶段沿着动物-植物轴进行混合, 可以产生大小减少的胚胎 12,13.然而, 在我们手中, 这种一步的方法会导致斑马鱼的背化或腹形胚胎, 大概是因为背侧决定因素分布不均, 人们无法从胚胎的形态中知道它们的定位。在这里, 我们演示了另一种两步切碎技术的斑马鱼, 产生正常发育, 但较小的胚胎。有了这一技术, 细胞首先从动物极点中取出, 这是一个缺乏组织者活动的天真细胞区域。为了平衡蛋黄和细胞的数量, 蛋黄被去除, 这对上皮和随后的形态发生很重要。在这里, 我们详细介绍了这个协议, 并给出了模式形成中大小不变性的两个例子;体细胞形成和腹侧神经管模式。结合定量成像, 我们利用尺寸缩小技术, 考察了体细胞和神经管的大小在减少胚胎大小方面的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
从历史上看, 在脊椎动物中, 大小缩小主要是使用两栖动物胚胎, 在第12条阶段沿动物-植物轴将胚胎一分为二.然而, 当我们将青蛙和斑马鱼胚胎一分为二时, 主要有两个区别。首先, 在斑马鱼胚胎耐受分分割 (囊胚阶段) 的阶段, 组织者位于脂肪边缘 18、19、20、21 的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了日本科学技术署 PRETO 方案 (JJPR11AA) 和国家卫生研究院赠款 (R01GM107733) 的支持。
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
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