Kirurgisk størrelse reduktion af Zebrafish til studiet af embryonale mønster skalering
Summary
Her beskriver vi en metode til at reducere størrelsen af zebrafiske embryoner uden at forstyrre normale udviklingsmæssige processer. Denne teknik gør det muligt at studere mønster skalering og udviklingsmæssig robusthed mod størrelsesændring.
Abstract
I den udviklingsmæssige proces, embryoner udviser en bemærkelsesværdig evne til at matche deres krop mønster til deres kropsstørrelse; deres legems andel opretholdes, selv i embryoner, der er større eller mindre, inden for visse grænser. Selv om dette fænomen med skalering har tiltrukket sig opmærksomhed i over et århundrede, forståelse af de underliggende mekanismer har været begrænset, skyldes til dels en mangel på kvantitativ beskrivelse af udviklingsmæssige dynamik i embryoner af forskellige størrelser. For at overvinde denne begrænsning, vi udviklet en ny teknik til kirurgisk at reducere størrelsen af: zebrafisk embryoner, som har store fordele for in vivo levende billeddannelse. Vi viser, at efter afbalanceret fjernelse af celler og æggeblomme på blastula scenen i separate trin, kan embryoner hurtigt komme sig under de rette betingelser og udvikle i mindre, men ellers normale embryoner. Da denne teknik ikke kræver særligt udstyr, er det let at tilpasse, og kan bruges til at studere en bred vifte af skalering problemer, herunder robustheden af morfogen medieret mønster.
Introduction
Forskerne har længe vidst, at embryoner har en bemærkelsesværdig evne til at danne konstante krops proportioner selv embryo størrelse kan variere meget både under naturlige og eksperimentelle betingelser1,2,3. Trods årtiers teoretiske og eksperimentelle undersøgelser er denne robusthed over for Størrelsesvariation, betegnet skalering og dens underliggende mekanismer stadig ukendt i mange væv og organer. For direkte at indfange dynamikken i udviklingssystemet etablerede vi en reproducerbar og enkel størrelses reduktions teknik i: zebrafisk4, som har den store fordel i in vivo Live imaging5.
Zebrafish har tjent som en model hvirveldyr til at studere flere discipliner af biologi, herunder udviklingsmæssige biologi. Især er zebrafisk ideel til in vivo levende billeddannelse6 fordi 1) udvikling kan fortsætte normalt uden for moderen og ægskallen, og 2) embryonerne er gennemsigtige. Desuden kan embryonerne modstå nogle temperatur-og miljømæssige udsving, som gør det muligt at undersøgt dem under laboratorieforhold. Også, ud over konventionelle genekspression forstyrrelse af morpholino og mRNA injektion7,8, seneste fremskridt i crispr/Cas9 teknologi har gjort reverse genetik i: zebrafisk meget effektiv9. Desuden kan mange klassiske teknikker i embryologi, såsom celletransplantation eller vævs kirurgi anvendes4,10,11.
Størrelses reduktionsteknikker blev oprindeligt udviklet i amfibie-og andre ikke-hvirveldyr12. For eksempel, i xenopus Elm, en anden populær hvirveldyr model, skæring langs dyret-Vegetal akse på blastula fase kan producere størrelse-reducerede embryoner12,13. Men i vores hænder denne One-Step tilgang resulterer i dorsalized eller ventraliserede embryoner i zebrafish, formentlig fordi rygterne determinanter fordeles ulige og man kan ikke kende deres lokalisering fra morfologien af embryoner. Her demonstrerer vi en alternativ to-trins hakke teknik til: zebrafisk, der producerer normalt udvikler, men mindre embryoner. Med denne teknik fjernes cellerne først fra dyre stangen, en region med naive celler, der mangler arrangør aktivitet. For at afbalancere mængden af æggeblomme og celler, som er vigtigt for epidriy og efterfølgende morfogenesis, er æggeblomme derefter fjernes. Her beskriver vi denne protokol og giver to eksempler på størrelse invarians i mønster dannelsen; somite og ventrale neurale rørmønster. Kombineret med kvantitativ billeddannelse udnyttede vi størrelses reduktions teknikken til at undersøge, hvordan størrelserne af somitter og neurale rør påvirkes i størrelse reducerede embryoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historisk set, blandt hvirveldyr, størrelse reduktion har været hovedsagelig udført ved hjælp af padde fostre, ved at halvering embryoner langs animalsk-Vegetal akse på en blastula etape12. Men der er hovedsagelig to forskelle mellem frø og zebrafiske embryoner, når vi krydser embryoner. Først, på det tidspunkt, hvor: zebrafisk embryoner bliver tolerante over for halvering (blastula fase), arrangøren er beliggende i et begrænset område af blastula margin<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af PRESTO-programmet fra Japans videnskabs-og teknologi agentur (JPMJPR11AA) og et national Institut for sundhedstilskud (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
