Chirurgische grootte vermindering van zebravis voor de studie van het embryonale patroon schrapen
Summary
Hier beschrijven we een methode om de grootte van zebravis embryo’s te verkleinen zonder de normale ontwikkelingsprocessen te verstoren. Deze techniek maakt de studie van het patroon schalen en ontwikkelingsstoornissen robuustheid tegen grootte te veranderen.
Abstract
In het ontwikkelingsproces, vertonen de embryo’s een opmerkelijke capaciteit om hun lichaams patroon aan hun lichaamsgrootte te passen; hun lichaamsdeel wordt gehandhaafd, zelfs in embryo’s die groter of kleiner zijn, binnen bepaalde grenzen. Hoewel dit fenomeen van de schaalvergroting heeft de aandacht getrokken voor meer dan een eeuw, het begrijpen van de onderliggende mechanismen is beperkt, deels als gevolg van een gebrek aan kwantitatieve beschrijving van de ontwikkelingsdynamiek in embryo’s van verschillende grootte. Om deze beperking te overwinnen, ontwikkelden we een nieuwe techniek om chirurgisch de grootte van zebravis embryo’s te verminderen, die grote voordelen hebben voor in vivo Live Imaging. Wij tonen aan dat na een evenwichtige verwijdering van cellen en dooier in de blastula fase in afzonderlijke stappen, embryo’s snel kunnen herstellen onder de juiste omstandigheden en zich ontwikkelen tot kleinere, maar anders normale embryo’s. Aangezien deze techniek geen speciale apparatuur nodig heeft, is het gemakkelijk aanpasbaar, en kan worden gebruikt om een breed scala van schaling problemen studie, met inbegrip van robuustheid van morphogen gemedieerde patroon.
Introduction
Wetenschappers weten al lang dat embryo’s een opmerkelijke mogelijkheid hebben om constante lichaamsverhoudingen te vormen, hoewel de embryo grootte sterk kan variëren, zowel onder natuurlijke als experimentele omstandigheden1,2,3. Ondanks decennia van theoretische en experimentele studies, blijft deze robuustheid aan grootte variatie, genoemd het schrapen, en zijn onderliggende mechanismen onbekend in vele weefsels en organen. Om de dynamiek van het ontwikkelingssysteem direct vast te leggen, hebben we een reproduceerbare en eenvoudige grootte reductie techniek in zebravis4, die het grote voordeel in in vivo Live Imaging5heeft.
Zebravis heeft gediend als een model gewervelde dier om meerdere disciplines van de biologie studie, met inbegrip van ontwikkelingsbiologie. In het bijzonder, zebravis is ideaal voor in vivo Live Imaging6 omdat 1) ontwikkeling kan normaal te werk gaan buiten de moeder en de eierschaal, en 2) de embryo’s zijn transparant. Bovendien zijn de embryo’s bestand tegen temperatuur-en milieu fluctuaties, waardoor ze in laboratoriumomstandigheden kunnen worden bestudeerd. Ook, in aanvulling op conventionele genexpressie verstoring door morpholino en mRNA injectie7,8, recente vooruitgang in de Crisper/Cas9 technologie heeft omgekeerde genetica in zebravis zeer efficiënte9. Bovendien kunnen vele klassieke technieken in embryologie, zoals cel transplantatie of weefsel chirurgie worden toegepast4,10,11.
De de verminderings technieken werden van de grootte oorspronkelijk ontwikkeld in amfibie en andere niet-gewervelde dieren12. Bijvoorbeeld, in Xenopus laevis, een ander populair gewervelde dierlijk model, Bisectie langs de dierlijk-plantaardige as in blastula stadium kan grootte-verminderde embryo’s12,13produceren. Echter, in onze handen deze One-Step benadering resulteert in dorsale of ventralized embryo’s in zebravis, vermoedelijk omdat dorsale determinanten ongelijk verdeeld en men kan niet weten wat hun lokalisatie van de morfologie van embryo’s. Hier tonen we een alternatieve twee-staps hakken techniek voor zebravis die normaal ontwikkelt, maar kleinere embryo’s produceert. Met deze techniek worden cellen voor het eerst verwijderd uit de dierlijke pool, een gebied van naïeve cellen ontbreekt in organisator activiteit. Om de hoeveelheid dooier en cellen in evenwicht te brengen, die voor epiboly en verdere morfogenese belangrijk is, wordt de dooier dan verwijderd. Hier, we detail dit protocol en bieden twee voorbeelden van grootte onveranderlijkheid in patroonvorming; Somiet vorming en buik neurale buis patroon. Gecombineerd met kwantitatieve beeldvorming, gebruikten we de grootte reductie techniek om te onderzoeken hoe de grootte van somieten en neurale buis worden beïnvloed in grootte verminderde embryo’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historisch, onder gewervelde dieren, is de grootte vermindering hoofdzakelijk uitgevoerd gebruikend amfibie embryo’s, door de embryo’s langs dierlijk-plantaardige as in een blastula stadium12te doorsnijdt. Echter, er zijn voornamelijk twee verschillen tussen kikker en zebravis embryo’s als we bisect embryo’s. Eerst, in het stadium wanneer de zebravis embryo’s tolerant van doorsnijdt (blastula stadium) worden, wordt de organisator gevestigd in een beperkt gebied van bla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door het PRESTO-programma van het Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) en een nationale instituten van Health Grant (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
