הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה להפחתת הגודל של עוברי דגים מבלי להפריע תהליכים התפתחותיים נורמליים. טכניקה זו מאפשרת לימוד שינוי קנה מידה וחוסן התפתחותי נגד שינוי גודל.
Abstract
בתהליך ההתפתחותי, עוברים מייצגים יכולת יוצאת דופן להתאים את דפוס הגוף שלהם לגודל גופם; פרופורציה הגוף שלהם נשמרת גם בעוברים גדולים או קטנים יותר, בגבולות מסוימים. למרות שתופעה זו של שינוי קנה מידה משכה תשומת לב במשך יותר ממאה שנה, הבנת המנגנונים הבסיסיים הוגבלה, בשל היעדר תיאור כמותי של הדינמיקה ההתפתחותית בעוברים בגדלים מגוונים. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו טכניקה חדשה בניתוח להפחית את הגודל של עוברי הדגים, אשר יש יתרונות גדולים עבור vivo live הדמיה. אנו מדגימים כי לאחר ההסרה מאוזנת של תאים וחלמון בשלב blastula בשלבים נפרדים, העוברים יכולים במהירות להתאושש תחת התנאים הנכונים ולהתפתח קטן יותר אך בדרך כלל נורמלי העוברים. מאחר שטכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד, היא ניתנת להתאמה בקלות, וניתן להשתמש בה כדי ללמוד מגוון רחב של בעיות בקנה מידה, כולל החוסן של בתיווך מורפוגן.
Introduction
מדענים ידועים זמן רב כי עוברים יש יכולת יוצאת דופן ליצור פרופורציות גוף קבוע למרות גודל העובר יכול להשתנות במידה רבה בתנאים טבעיים וניסיוניים1,2,3. למרות עשורים של מחקרים תיאורטיים וניסיוניים, החוסן הזה לשינוי גודל, נקרא שינוי קנה מידה, והמנגנונים הבסיסיים שלהם נשארים בלתי ידועים ברקמות ובאיברים רבים. על מנת ללכוד באופן ישיר את הדינמיקה של המערכת המתפתחת, הקמנו טכניקה הפחתת גודל פשוט של הפחתה ב-דג זברה4, אשר יש את היתרון הגדול ב vivo live הדמיה5.
זברפיש שימש כבעל חוליות מודל לחקר דיסציפלינות מרובות של ביולוגיה, כולל ביולוגיה התפתחותית. בפרט, דג דג זברה הוא אידיאלי עבור vivo live הדמיה6 כי 1) הפיתוח יכול להמשיך בדרך כלל מחוץ לאם ואת קליפת הביצה, ו 2) העוברים שקופים. בנוסף, העוברים יכולים לעמוד בטמפרטורה ובתנודות סביבתיות, המאפשרים להם ללמוד בתנאי מעבדה. כמו כן, בנוסף הביטוי הגן הקונבנציונלי הפרטורציה על ידי הזרקת גוורסטינו ו mrna הזרקה7,8, ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית crispr/Cas9 עשה גנטיקה הפוכה ב-דג זברה יעיל מאוד9. יתר על כן, טכניקות קלאסיות רבות ב אמבריולוגיה, כגון השתלת תאים או ניתוח רקמות ניתן להחיל4,10,11.
הפחתת גודל טכניקות פותחו במקור בעלי חיים שאינם בעלי חוליות12. לדוגמה, ב- xenopus זריזה, עוד מודל פופולרי בעלי חוליות בעלי החיים, החצייה לאורך ציר החי-ווגטל בשלב blastula, יכולים לייצר עוברים מופחתים בגודל12,13. עם זאת, בידינו זו גישה צעד אחד תוצאות העוברים מאואמים או מונאמים ב-zebrafish, ככל הנראה משום שהדטרמיניזם הדו מופץ ללא שינוי ואין לדעת את הלוקליזציה שלהם מתוך המבנה של העוברים. כאן אנו להדגים טכניקה חלופית דו-שלבים לחיתוך באמצעות הדגים המייצרת בדרך כלל אך עוברים קטנים יותר. עם טכניקה זו, תאים מוסרים לראשונה מן הקוטב חיה, אזור של תאים תמימים חסר פעילות ארגונית. כדי לאזן את כמות החלמון והתאים, שהוא חשוב עבור epiboly והבאים מורפוגנזה, חלמון מוסר לאחר מכן. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול זה ולספק שתי דוגמאות של קבוע גודל במבנה תבנית; היווצרות הצינור העצבי הגחון. בשילוב עם הדמיה כמותית, אנו משתמשים בטכניקת הפחתת גודל כדי לבחון את האופן שבו גדלים של שפופרת העצבים והצינורית העצבית מושפעים מהעוברים מופחתים בגודל.
Protocol
Representative Results
Discussion
היסטורית, בין בעלי חוליות, הפחתת גודל מבוצעת בעיקר באמצעות עוברי אמפיבי, על ידי ביצוע העוברים לאורך ציר החי-צמחי בשלב blastula12. עם זאת, ישנם בעיקר שני הבדלים בין הצפרדע לעוברים עוברי דגים כאשר אנו ביסעי עוברים. ראשון, על הבמה כאשר העוברים משתדגים להיות סובלני של בי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי תוכנית מפרסטו של יפן מדעי וטכנולוגיה הסוכנות (JPMJPR11AA) ומכונים לאומיים של מענק בריאות (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
