Kirurgisk Størrelsesreduksjon av sebrafisk for studiet av embryonale mønster skalering
Summary
Her beskriver vi en metode for å redusere størrelsen på sebrafisk embryo uten å forstyrre normale utviklingsprosesser. Denne teknikken gjør det mulig å studere mønster skalering og utviklingsmessige robusthet mot størrelsesendring.
Abstract
I utviklingsprosessen, embryo viser en bemerkelsesverdig evne til å matche deres kropps mønster til sin kroppsstørrelse; deres kropps andel opprettholdes selv i embryo som er større eller mindre, innenfor visse grenser. Selv om dette fenomenet skalering har tiltrukket seg oppmerksomhet i over et århundre, forstå de underliggende mekanismene har vært begrenset, skyldes delvis en mangel på kvantitativ beskrivelse av utviklingsmessige dynamikk i embryo av varierte størrelser. For å overvinne denne begrensningen, utviklet vi en ny teknikk for å kirurgisk redusere størrelsen på sebrafisk embryo, som har store fordeler for in vivo Live Imaging. Vi viser at etter balansert fjerning av celler og eggeplomme på Blastulastadiet scenen i separate trinn, kan embryo raskt komme seg under de rette forholdene og utvikle seg til mindre, men ellers normalt embryo. Siden denne teknikken ikke krever spesialutstyr, er det lett å tilpasse, og kan brukes til å studere et bredt spekter av Skalerings problemer, inkludert robusthet av morphogen mediert mønster.
Introduction
Forskere har lenge visst at embryo har en bemerkelsesverdig evne til å danne konstant kropps proporsjoner selv om embryo størrelse kan variere sterkt både under naturlige og eksperimentelle forhold1,2,3. Til tross for ti år med teoretiske og eksperimentelle studier, denne robusthet til størrelse variasjon, kalt skalering, og dens underliggende mekanismer forblir ukjent i mange vev og organer. For å direkte fange dynamikken i utviklingssystemet, etablerte vi en reproduserbar og enkel størrelsesreduksjon teknikk i sebrafisk4, som har den store fordelen i in vivo Live Imaging5.
Sebrafisk har fungert som en modell virveldyr dyr å studere flere disipliner av biologi, inkludert utviklingsmessige biologi. Spesielt er sebrafisk ideell for in vivo Live Imaging6 fordi 1) utviklingen kan fortsette normalt utenfor mor og eggeskall, og 2) embryo er gjennomsiktige. I tillegg kan embryo tåle noen temperatur og miljømessige svingninger, som tillater dem å bli studert i laboratorieforhold. Også, i tillegg til konvensjonelle genuttrykk forstyrrelsene av morpholino og mRNA injeksjon7,8, nylige fremskritt i CRISPR/Cas9 teknologi har gjort omvendt genetikk i sebrafisk svært effektiv9. Videre kan mange klassiske teknikker i embryologi, for eksempel celle transplantasjon eller vevs kirurgi påføres4,10,11.
Størrelsesreduksjon teknikker ble opprinnelig utviklet i amfibier og andre ikke-virveldyr dyr12. For eksempel, i Xenopus laevis, en annen populær virveldyr dyremodell, bisection langs dyret-vegetal aksen på Blastulastadiet stadiet kan produsere størrelse-redusert embryo12,13. Men i våre hender denne ett-trinns tilnærming resulterer i dorsalized eller ventralized embryo i sebrafisk, antagelig fordi rygg faktorer er fordelt ujevnt og man kan ikke kjenne sin lokalisering fra morfologi av embryo. Her viser vi en alternativ to-trinns hakke teknikk for sebrafisk som produserer normalt utvikling, men mindre embryo. Med denne teknikken, celler er først fjernet fra dyret polet, en region av naive celler mangler i arrangøraktivitet. For å balansere mengden av eggeplomme og celler, noe som er viktig for epiboly og påfølgende morphogenesis, eggeplomme blir deretter fjernet. Her detalj vi denne protokollen og gir to eksempler på størrelse invarians i mønsteret formasjon; somite dannelse og ventrale mønstre for nevrale rør. Kombinert med kvantitativ bildebehandling, benyttet vi størrelsesreduksjon teknikk for å undersøke hvordan størrelsene på somites og neural tube er påvirket i størrelse redusert embryo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historisk blant virveldyr dyr, har størrelsesreduksjon blitt hovedsakelig utført ved hjelp amfibier embryo, ved å halverer embryo langs dyr vegetal aksen på et Blastulastadiet trinn12. Men det er i hovedsak to forskjeller mellom frosk og sebrafisk embryo når vi halvere embryo. Først på scenen når sebrafisk embryo blir tolerant av halverer (Blastulastadiet Stadium), arrangøren ligger i et begrenset område av Blastulastadiet margin18<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av PRESTO-programmet i Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) og en National Institutes of Health Grant (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
