Summary

Redução cirúrgica do tamanho do zebrafish para o estudo da escala padrão embrionária

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Aqui, nós descrevemos um método para reduzir o tamanho de embriões do zebrafish sem interromper processos desenvolventes normais. Esta técnica permite o estudo da escala do teste padrão e do robustez desenvolvente de encontro à mudança do tamanho.

Abstract

No processo de desenvolvimento, os embriões exibem uma habilidade notável de combinar seu teste padrão do corpo a seu tamanho de corpo; sua proporção corporal é mantida mesmo em embriões que são maiores ou menores, dentro de certos limites. Embora este fenômeno de escamação tenha atraído a atenção por mais de um século, a compreensão dos mecanismos subjacentes tem sido limitada, devido em parte à falta de descrição quantitativa da dinâmica do desenvolvimento em embriões de tamanhos variados. Para superar esta limitação, nós desenvolvemos uma técnica nova para reduzir cirùrgica o tamanho de embriões do zebrafish, que têm grandes vantagens para a imagem latente vivo in vivo. Nós demonstramos que após a remoção equilibrada das pilhas e da gema no estágio da blástula em etapas separadas, os embriões podem rapidamente recuperar-se as circunstâncias direitas e tornar-se em embriões menores mas de outra maneira normais. Desde que esta técnica não exige o equipamento especial, é facilmente adaptável, e pode ser usada para estudar uma escala larga de problemas de escamação, incluindo o robustez do patterning mediado morfogênico.

Introduction

Os cientistas têm sabido por muito tempo que os embriões têm uma habilidade notável de dar forma a proporções constantes do corpo embora o tamanho do embrião possa variar extremamente circunstâncias naturais e experimentais1,2,3. Apesar de décadas de estudos teóricos e experimentais, essa robustez à variação de tamanho, denominada escamação, e seus mecanismos subjacentes permanecem desconhecidos em muitos tecidos e órgãos. Para captar diretamente a dinâmica do sistema em desenvolvimento, estabeleceu-se uma técnica de redução de tamanho simples e reprodutível em zebrafish4, que tem a grande vantagem em imagens ao vivo in vivo5.

Zebrafish serviu como um animal modelo vertebrado para estudar várias disciplinas da biologia, incluindo a biologia do desenvolvimento. Em particular, o zebrafish é ideal para a imagem latente vivo6 de in vivo porque 1) o desenvolvimento pode prosseguir normalmente fora da mãe e do escudo de ovo, e 2) os embriões são transparentes. Além disso, os embriões podem resistir a alguma temperatura e flutuações ambientais, o que permite que eles sejam estudados em condições laboratoriais. Além da perturbação da expressão gênica convencional pela injeção de morfolino emRNA7,8, avanços recentes na tecnologia crispr/Cas9 tornaram a genética reversa em zebrafish altamente eficiente9. Além disso, muitas técnicas clássicas em embriologia, como transplante celular ou cirurgia tecidual, podem seraplicadas 4,10,11.

As técnicas de redução de tamanho foram originalmente desenvolvidas em anfíbios e outros animais não vertebrados12. Por exemplo, no Xenopus laevis, outro modelo popular de animais vertebrados, a bisection ao longo do eixo animal-vegetal na fase blástula pode produzir embriões com redução de tamanho12,13. Entretanto, em nossas mãos esta aproximação de uma etapa conduz aos embriões dorsalizados ou ventralized no zebrafish, presumivelmente porque os determinantes dorsais são distribuídos desigual e um não pode saber sua localização da morfologia dos embriões. Aqui nós demonstramos uma técnica de corte de duas etapas alternativa para o zebrafish que produz embriões normalmente tornando-se mas menores. Com esta técnica, as pilhas são removidas primeiramente do pólo animal, uma região das pilhas ingênuas que faltam na atividade do organizador. Para equilibrar a quantidade de gemas e células, que é importante para a Epibolia e posterior morfogênese, gema é então removida. Aqui, detalhamos este protocolo e fornecemos dois exemplos de invariância de tamanho na formação de padrões; formação somita e padronização do tubo neural ventral. Combinado com a imagem latente quantitativa, nós utilizamos a técnica da redução do tamanho para examinar como os tamanhos dos somitos e do tubo neural são afetados em embriões reduzidos tamanho.

Protocol

Todos os procedimentos relacionados aos peixes foram realizados com a aprovação da Comissão de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC) na Harvard Medical School. 1. preparação da ferramenta e do reagente Faça um loop de arame para cortar embriões Tomar 20 cm de fio de aço inoxidável que é rígida e não corrosivo com um diâmetro de 40 μm. Loop o fio através de vidro capilar (1,0 mm diâmetro exterior, 0,5 mm diâmetro…

Representative Results

A redução do volume de yolk é importante para a morfologia normalComo descrito recentemente em Almuedo-Castillo et al.17, a redução do tamanho dos embriões pode ser alcançada sem reduzir o volume de gema. Para comparação com e sem redução do volume de gemas, realizamos tanto o corte em duas etapas (tanto blástula quanto gema) e o corte somente de blástula (Figura 2 e filme suplementar 1). Embriões picados em duas eta…

Discussion

Historicamente, entre os animais vertebrados, a redução do tamanho tem sido realizada principalmente com embriões de anfíbios, dividindo os embriões ao longo do eixo animal-vegetal em uma fase de blástula12. No entanto, existem principalmente duas diferenças entre os embriões de rã e de zebrafish quando Bisect embriões. Primeiro, no estágio em que os embriões de zebrafish se tornam tolerantes à dividindo (fase blástula), o organizador está localizado em …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho foi apoiado pelo programa PRESTO da Agência de ciência e tecnologia do Japão (JPMJPR11AA) e um subsídio nacional de institutos de saúde (R01GM107733).

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

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Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

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