Хирургическое уменьшение размера рыбы данио для изучения эмбрионального масштабирования шаблона
Summary
Здесь мы описываем метод уменьшения размера эмбрионов рыб данио без нарушения нормального процесса развития. Этот метод позволяет изучить масштабирование шаблона и устойчивость развития от изменения размера.
Abstract
В процессе развития, эмбрионы демонстрируют замечательную способность соответствовать их телу тела к их размеру тела; их доля тела поддерживается даже в эмбрионов, которые крупнее или меньше, в определенных пределах. Хотя это явление масштабирования привлекает к себе внимание на протяжении более века, понимание базовых механизмов ограничено, отчасти из-за отсутствия количественного описания динамики развития эмбрионов различных размеров. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали новую технику, чтобы хирургически уменьшить размер зародышей рыб данио, которые имеют большие преимущества для в естественных условиях живой визуализации. Мы показываем, что после сбалансированного удаления клеток и желтка на стадии блабулы в отдельных шагах, эмбрионы могут быстро восстановиться при правильных условиях и развиться в меньшие, но в остальном нормальные эмбрионы. Так как этот метод не требует специального оборудования, он легко адаптируется, и может быть использован для изучения широкого спектра проблем масштабирования, в том числе устойчивость морфгена опосредованного паттерна.
Introduction
Ученые давно знают, что эмбрионы обладают замечательной способностью формировать постоянные пропорции тела, хотя размер эмбриона может сильно различаться как в естественных, так и в экспериментальных условиях1,2,3. Несмотря на десятилетия теоретических и экспериментальных исследований, эта устойчивость к размеру вариации, называется масштабирование, и его основные механизмы остаются неизвестными во многих тканях и органах. Для того, чтобы непосредственно захватить динамику развивающейся системы, мы создали воспроизводимые и простой метод уменьшения размера в данио4, который имеет большое преимущество в в естественных условиях живой визуализации5.
Рыба данио служила моделью позвоночных животных для изучения нескольких дисциплин биологии, включая биологию развития. В частности, рыба данио идеально подходит для в естественных условиях живой визуализации6 , потому что 1) развитие может протекать нормально вне матери и яичной скорлупы, и 2) эмбрионы прозрачны. Кроме того, эмбрионы могут выдерживать некоторые температурные и экологические колебания, что позволяет им изучаться в лабораторных условиях. Кроме того, в дополнение к обычному экспрессии генов возмущений Морфолино и мРНК инъекции7,8, последние достижения в области технологии криср/Cas9 сделал обратный генетики в данио рыб высокоэффективных9. Кроме того, многие классические методы эмбриологии, такие как трансплантация клеток или тканевой хирургии могут быть применены4,10,11.
Методы сокращения размера были первоначально разработаны в амфибии и других не позвоночных животных12. Например, в ксенопус laevis, другой популярной модели позвоночных животных, бискция вдоль оси животного растительного на стадии блазула может производить размер-сокращение эмбрионов12,13. Однако, в наших руках этот одноэтапный подход приводит к дорсизированных или вентризованных эмбрионов в рыбе данио, предположительно потому, что спинной детерминанты распределяются неравномерно и никто не может знать их локализацию от морфологии эмбрионов. Здесь мы демонстрируем альтернативный двухступенчатый рубящий технику для рыб данио, который производит обычно развивается, но меньше эмбрионов. С помощью этой техники, клетки сначала удаляются из животного полюса, область наивных клеток не хватает в органайзер деятельности. Чтобы сбалансировать количество желтка и клеток, что важно для эпибооли и последующего морфогенеза, желток удаляется. Здесь мы подробно этот протокол и представить два примера размера инности в формировании шаблона; формирование сомита и брюшной нервной трубки паттерн. В сочетании с количественной визуализации, мы использовали технику уменьшения размера, чтобы изучить, как размеры сомитов и нервной трубки страдают в размерах уменьшается эмбрионов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исторически, среди позвоночных животных, размер сокращение было в основном осуществляется с использованием амфибий эмбрионов, путем рассеяние эмбрионов по оси животного растительного на блаукула этап12. Однако, есть в основном два различия между лягушки и ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана программой вуаля японского агентства по науке и технике (JPMJPR11AA) и гранта национального института здравоохранения (R01GM107733).
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
- Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
- Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
- Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
- Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
- Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
- Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
- Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
- Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
- Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
- Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
- Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).
