Summary

Reducción de tamaño quirúrgico del pez cebra para el estudio de la escala de patrón embrionario

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Aquí describimos un método para reducir el tamaño de los embriones de pez cebra sin interrumpir los procesos normales de desarrollo. Esta técnica permite el estudio de la escala del patrón y la robustez del desarrollo contra el cambio de tamaño.

Abstract

En el proceso de desarrollo, los embriones exhiben una notable capacidad para igualar su patrón corporal con su tamaño corporal; su proporción corporal se mantiene incluso en embriones que son más grandes o más pequeños, dentro de ciertos límites. Aunque este fenómeno de escala ha atraído la atención durante más de un siglo, la comprensión de los mecanismos subyacentes ha sido limitada, debido en parte a la falta de una descripción cuantitativa de la dinámica del desarrollo en embriones de tamaños variados. Para superar esta limitación, desarrollamos una nueva técnica para reducir quirúrgicamente el tamaño de los embriones de pez cebra, que tienen grandes ventajas para la imagen en vivo in vivo. Demostramos que después de la eliminación equilibrada de las células y la yema en la fase blástula en pasos separados, los embriones pueden recuperarse rápidamente bajo las condiciones adecuadas y convertirse en embriones más pequeños pero de otro modo normales. Dado que esta técnica no requiere equipo especial, es fácilmente adaptable y se puede utilizar para estudiar una amplia gama de problemas de escalado, incluida la robustez de los patrones mediada por morfogeno.

Introduction

Los científicos han sabido desde hace tiempo que los embriones tienen una capacidad notable para formar proporciones corporales constantes, aunque el tamaño del embrión puede variar grandemente tanto en condiciones naturales como experimentales1,2,3. A pesar de décadas de estudios teóricos y experimentales, esta robustez a la variación de tamaño, denominada escalado, y sus mecanismos subyacentes siguen siendo desconocidos en muchos tejidos y órganos. Con el fin de captar directamente la dinámica del sistema en desarrollo, establecimos una técnica de reducción de tamaño reproducible y simple en el pez cebra4, que tiene la gran ventaja de la imagen en vivo in vivo5.

El pez cebra ha servido como un animal vertebrado modelo para estudiar múltiples disciplinas de la biología, incluyendo la biología del desarrollo. En particular, el pez cebra es ideal para imágenes en vivo in vivo6 porque 1) el desarrollo puede proceder normalmente fuera de la madre y la cáscara de huevo, y 2) los embriones son transparentes. Además, los embriones pueden soportar algunas fluctuaciones de temperatura y ambientales, lo que les permite ser estudiados en condiciones de laboratorio. También, además de la perturbación convencional de la expresión génica por morfolinos y mRNA injection7,8, los avances recientes en la tecnología CRISPR/Cas9 han hecho que la genética inversa en el pez cebra altamente eficiente9. Además, muchas técnicas clásicas en la embriología, como el trasplante de células o la cirugía de tejidos se pueden aplicar4,10,11.

Las técnicas de reducción de tamaño se desarrollaron originalmente en anfibios y otros animales no vertebrados12. Por ejemplo, en Xenopus laevis, otro modelo animal de vertebrado popular, la bisección a lo largo del eje animal-vegetal en blástula Stage puede producir embriones reducidos de tamaño12,13. Sin embargo, en nuestras manos este enfoque de un solo paso da lugar a embriones dorsalizados o ventralizados en el pez cebra, presumiblemente porque los determinantes dorsales se distribuyen de manera desigual y uno no puede conocer su localización de la morfología de los embriones. Aquí demostramos una técnica alternativa de troceo de dos pasos para el pez cebra que produce embriones normalmente en desarrollo pero más pequeños. Con esta técnica, las células se eliminan por primera vez del polo animal, una región de células ingenuas que carecen de actividad organizadora. Para equilibrar la cantidad de yemas y células, que es importante para la morfogénesis epibolia y posterior, la yema se retira. Aquí, detallamos este protocolo y proporcionamos dos ejemplos de invarianza de tamaño en la formación de patrones; formación de somita y patrón de tubo neural ventral. En combinación con la imagen cuantitativa, utilizamos la técnica de reducción de tamaño para examinar el modo en que los tamaños de las somitas y el tubo neural se ven afectados por el tamaño de los embriones reducidos.

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con el pescado se llevaron a cabo con la aprobación del Comité institucional de atención y uso de animales (IACUC) en la escuela de medicina de Harvard. 1. preparación de herramientas y reactivos Haga un lazo de alambre para picar los embriones Tomar 20 cm de alambre de acero inoxidable rígido y no corrosivo con un diámetro de 40 μm. Conecte el alambre a través del capilar de vidrio (diámetro …

Representative Results

La reducción del volumen de Yolk es importante para la morfología normalComo se ha descrito recientemente en Almuedo-Castillo et al.17, la reducción del tamaño de los embriones puede lograrse sin reducir el volumen de la yema. Para comparar con y sin la reducción del volumen de la yema, realizamos tanto el picado de dos pasos (tanto blástula como yema) y el picado de blástula (figura 2 y película complementaria 1). Los emb…

Discussion

Históricamente, entre los animales vertebrados, la reducción de tamaño se ha realizado principalmente utilizando embriones de anfibios, mediante la bisección de los embriones a lo largo del eje animal-vegetal en una etapa de blástula12. Sin embargo, existen principalmente dos diferencias entre los embriones de rana y pez cebra cuando biseccionamos embriones. En primer lugar, en la etapa en que los embriones de pez cebra se vuelven tolerantes de bisección (blástu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo fue apoyado por el programa PRESTO de la Agencia de ciencia y tecnología de Japón (JPMJPR11AA) y una subvención de los institutos nacionales de salud (R01GM107733).

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

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Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

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