JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
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Protocol
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면역학 및 감염병학

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

本論文では、免疫エリミターへの曝露後のアラビドプシス・タリアナにおける防御応答を定量化する2つの方法について、一過性酸化バーストと苗増殖の抑制について述べた。

Abstract

植物は病原体を知覚し、病気から保護するために堅牢な免疫システムを進化させてきました。本論文では、エリクティター分子による治療後のアラビドプシスタリアナにおける免疫活性化の強度を測定するために使用できる2つのアッセイについて述べた。最初に提示されるのは、急速に誘発され、動的酸化バーストを捕捉する方法であり、これはルミノール系アッセイを用いて監視することができる。第2に提示されるのは、苗増殖の免疫誘発阻害を測定する方法を説明する方法である。これらのプロトコルは、高速かつ信頼性が高く、専門的なトレーニングや機器を必要とせず、植物免疫の遺伝的基礎を理解するために広く使用されています。

Introduction

病原体を知覚し防御するために、植物は微生物関連分子パターン(MAMP)1として知られている細胞外の保存された微生物分子を検出する膜結合パターン認識受容体(PRR)を進化させました。彼らの認知PRRへのMAMPの結合は、広いスペクトル疾患耐性2をもたらすタンパク質キナーゼ媒介免疫シグナル伝達を開始する。PRR活性化後の最も初期の応答の1つは、細胞外活性酸素種(ROS)の産生を触媒する一体型血漿膜呼吸バーストオキシダーゼホモログ(RBOH)タンパク質のリン酸化と活性化である3,4.ROSは、疾患耐性を確立する上で重要な役割を果たし、免疫シグナル伝達を伝播する二次メッセンジャーとして作用するとともに、直接抗菌剤5.免疫誘発性酸化バーストの最初の観察は、フィトフソラインフェタン接種6に続くcv.リシリのジャガイモ塊茎を用いて説明した。ROS産生は、葉ディスク7、細胞懸濁培養物8、およびプロトプラス6を用いていくつかの植物種で評価されている。ここで説明する、アラビドプシス・タリアナ(アラビドプシス)の葉ディスクでパターントリガROS産生をアッセイするための簡単な方法である。

MAMP知覚に対する応答として、活性RBOHタンパク質は、過酸化水素(H2 O)に変換されるスーパーオキシドラジカル(O2-)、ヒドロキシルラジカル(•OH)、およびシングルト酸素(1O2)の産生を触媒する。2)細胞外空間9中。H2O2は、酸化剤ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)10の存在下でルミノール系ケミルミネッセンスにより定量することができる。 HRPは、光10の光子を放出する不安定な中間体を生成するためにルミノールと反応する水酸化イオン(OH−)および酸素ガス(O2)を生成するH2O2を酸化する。 光子の放出は、ほとんどの分子実験室で標準的な装置となっている発光を検出することができるマイクロプレートリーダーまたはイメージャーを使用して相対光単位(LLU)として定量することができる。40〜60分間隔で生成された光を測定することにより、一過性酸化バーストは、エリキシーター処理後2〜5分後に早くも検出することができ、10〜20分でピークに達し、〜60分後に基底レベルに戻る。この時間コースで生成された累積光は、RBOHタンパク質12の活性化に対応する免疫強度の尺度として使用することができる。便利なことに、このアッセイは、特殊な機器や面倒なサンプル調製を必要としません。

MAMP検出直後にピークを迎え、酸化バーストはMAPK活性化およびエチレン産生5と共に早期免疫応答と考えられる。その後の免疫応答には、転写リプログラミング、腹腔閉鎖、およびカロース堆積2、5が含まれる。MSPへの長期暴露は、エネルギー的に高価な免疫シグナル伝達を継続的に活性化し、植物の成長の阻害をもたらし、開発と免疫13との間のトレードオフを示す。パターン誘発苗増殖抑制(SGI)は、アラビドプシスにおける免疫出力を評価するために広く使用され、PRR14、15を含む免疫シグナル伝達のいくつかの主要成分の同定に不可欠であった、16.したがって、本論文はさらに、アラビドプシスにおけるパターントリガSGIのアッセイを提示し、それによって苗は、標準的な媒体または免疫エリケータを8〜12日間補充したマルチウェルプレートで成長し、その後計量した。分析スケールを使用します。

ROSおよびSGIアッセイを使用してPRR媒介シグナリングを監視する方法を実証するために、様々な免疫出力を表す3つの遺伝子型が選択されました:(1)野生型アラビドプシス加盟コロンビア(Col-0)、(2)優勢陰性bak1-5 多機能PRR共受容体BRASSINOSTEROID無感受性1-関連キナーゼ1(BAK1)が免疫シグナル伝達17、18、および(3)劣性cpk28-1変異体において非機能である変異体は、調節タンパク質カルシウム依存性タンパク質キナーゼ28(CPK28)および高められた免疫誘発応答19,20を表示する。ROSおよびSGIアッセイは、細菌伸長因子Tu(EF-Tu)の合成産生elf18ペプチドエピトープに応答して提示され、PRR EF-Tu受容体(EFR)15によってアラビドプシスで認識される。これらのプロトコルは、細菌運動性タンパク質フラゲリン14または内因性植物エリシエータタンパク質(AtPeps)16などの他の免疫エリケータと共に使用することができるが、植物の応答性は、引き出し器21.ROSおよびSGIアッセイを組み合わせることで、PRR媒介応答の早期および後期の迅速かつ定量的評価に使用できます。

Protocol

1. 免疫引き出し後のアラビドプシス葉ディスクにおけるROSバーストの検出 植物の成長とメンテナンス。 発芽を同期させるには、無菌0.1%寒天[w/v]の1mLで約50種を懸濁し、3〜4日間4°C(光なし)に保存してアラビドプシス種子を層化します。注: 野生型のバックグラウンド コントロール (Col-0 など) と、免疫出力が高く低い遺伝子型(cpk28-1とbak1-5など) を内?…

Representative Results

変異型cpk28-119、25およびbak1-517、18植物は、それぞれ酸化バーストおよびSGIにおいて、高および低免疫応答を有するゲノタイプの期待される結果を実証するために使用された。野生型のバックグラウンドコントロール(Col-0)に対するアッセイ。用量依存性効果を評価す?…

Discussion

本論文では、アラビドプシスにおけるパターン誘発免疫応答をアッセイする2つの方法について述べ、特殊な装置を使用せずに免疫出力を評価する定量的アプローチを提供する。組み合わせで、パターントリガROSとSGIは、それぞれ微生物知覚に対する早期および後期の応答を評価するために使用することができる。

酸化バーストアッセイの主な制限は変動性です。?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちの研究室での仕事は、カナダの天然資源工学研究評議会(NSERC)ディスカバリープログラム、カナダイノベーション財団ジョンR.エバンスリーダーズファンド、クイーンズ大学を通じて資金提供されています。KSとISは、マスター学生のためのオンタリオ州大学院奨学金とNSERCカナダ大学院奨学金(CGS-M)によってサポートされています。

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
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