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Abstract
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면역학 및 감염병학

애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

Published: May 21, 2019
doi:
10.3791/59437
, , ,
1Department of Biology,Queen’s University

Summary

이 논문은 면역 점구체에 노출 된 후 애기장대에서 방어 반응을 정량화하는 두 가지 방법, 즉 일시적인 산화 파열 및 모종 성장 억제에 대해 설명합니다.

Abstract

식물은 병원균을 인식하고 질병으로부터 보호하기 위해 강력한 면역 체계를 발전시고 있습니다. 이 논문은 유도체 분자를 사용한 치료 후 애기장대에서 면역 활성화의 강도를 측정하는 데 사용할 수 있는 2개의 검정을 기술합니다. 먼저 제시된 것은 루미놀 계 분석법을 사용하여 모니터링될 수 있는 급속하게 유도되고 동적 산화 버스트를 포착하는 방법이다. 제시된 두 번째는 모종 성장의 면역 유발 억제를 측정하는 방법을 설명하는 방법이다. 이 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수 있으며 전문 교육이나 장비가 필요하지 않으며 식물 면역의 유전 적 기초를 이해하는 데 널리 사용됩니다.

Introduction

병원체에 대하여 인식하고 방어하기 위하여는, 식물은 미생물 관련 분자 패턴 (MAMPs)로 알려져 있는 세포 외부보존된 미생물 분자를 검출하는막 결합한 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 진화했습니다 1. 그들의 동족 PR에 MAMPs의 결합은 광범위한 질병 저항성의 결과로 단백질 키나제 매개면역 신호질을 개시합니다 2. PRR 활성화 다음 초기 반응 중 하나는 세포 외 반응성 산소 종 (ROS)의 생산을 촉매 하는 일체형 플라즈마 막 호흡 버스트 OXIDASE HOMOLOG (RBOH) 단백질의 인산화 및 활성화3 , 4.ROS는 면역 신호를 전파하는 보조 메신저뿐만 아니라 직접 항균제로서모두 작용하여 질병 내성을 확립하는 데 중요한 역할을 한다 5. 면역 유도산화 파열의 첫번째 관측은 피토프토라 감염증 접종후리시리의 감자 덩이줄기를 사용하여 기술되었다 6. ROS 생산은 잎 디스크 7, 세포현탁액 배양8,및 프로토 플라스톱 종6을사용하여 여러 식물 종에서 평가되었다. 여기서 설명된 것은 애기장대(애기장대)의 잎 디스크에서 패턴 트리거된ROS 생산을 위한 간단한 방법이다.

MAMP 지각에 대한 반응으로, 활성화된 RBOH 단백질은 과산화수소(H2O)로 변환되는 수퍼옥사이드 라디칼(O2–), 하이드록실 라디칼(•OH) 및 일중염 산소(1 O2)의 생산을 촉매합니다. 2)세포 외공간에서 9. H2O2는 산화제 고추냉이 과산화제(HRP)10의존재 에서 루미놀 계 케미발광에 의해 정량화될 수 있다. HRP는 H2O2를 산화하여 수산화이온(OH−)및 산소 가스(O2)를 발생시키고 루미놀과 반응하여 빛의 광자(10)를 방출하는 불안정한 중간체를 생성한다. 광자 방출은 대부분의 분자 실험실에서 장비의 표준 조각이된 발광을 감지 할 수있는 마이크로 플레이트 리더 또는 이미저를 사용하여 상대 광 단위 (RUS)로 정량화 될 수 있습니다. 40-60분 간격으로 생성된 빛을 측정함으로써, 과도 산화 파열은 유도체 처리 후 2-5분, 10-20분에서 정점에 도달하고, ~60분11후기저 수준으로 되돌아오는 것으로 조기에 검출될 수 있다. 이 시간 동안 생성된 누적 광은 RBOH 단백질(12)의 활성화에상응하는 면역 강도의 척도로서 사용될 수 있다. 편리하게, 이 분석법은 특수 한 장비 또는 성가신 샘플 준비를 필요로하지 않습니다.

MAMP 검출 직후에 피크, 산화 버스트는 MAPK 활성화 및 에틸렌 생산과 함께초기 면역 반응으로 간주됩니다 5. 이후 면역 반응은 전사 재프로그래밍, 구내 폐쇄 및 칼로오스증착 2,5를포함한다. MAMMp에 장기간 노출되면 식물 성장의 억제를 초래하는 에너지 비용이 많이 드는 면역 신호가 지속적으로 활성화되어개발과 면역 13 사이의 절충을 나타냅니다. 패턴 트리거 모종 성장 억제 (SGI)는 널리 애기장대에서 면역 출력을 평가하는 데 사용되며 PRRs14,15를 포함한 면역 신호의 여러 주요 구성 요소의 식별에 필수적이었다 ,16. 따라서, 이 논문은 또한 애기장대에서패턴 트리거 SGI에 대한 분석서를 제시하며, 이에 따라 모종은 8-12일 동안 면역 점구체로 보충된 표준 용지 또는 미디어를 포함하는 다중 웰 플레이트에서 재배된 다음 무게를 측정합니다. 분석 척도를 사용하여

ROS 및 SGI 분석이 PRR 매개 신호를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 입증하기 위해 다양한 면역 출력을 나타내는 세 가지 유전자형이 선택되었습니다: (1) 야생 형 애기장대 수탁콜롬비아 (Col-0), (2) 지배적 인 음성 bak1-5 다기능 PRR 공동 수용체 브라시노스테로이드 무감각 1-관련 키나제 1(BAK1)이 면역 신호에 비기능성 인 돌연변이체17,18,및 (3) 열성 cpk28-1 돌연변이가 결여되어 있는 돌연변이체는 조절 단백질 칼슘 의존 단백질 키나제 28 (CPK28) 및 높게 한 면역 트리거 반응을 표시19,20. ROS 및 SGI 세포는 PRR EF-Tu 수용체(EFR)15에의해 애기장대에서 인식된 세균 신장률 투(EF-Tu)의 합성 생산 된 elf18 펩티드 에피토프에 대한 응답으로 제시된다. 이러한 프로토콜은 세균성 운동성 단백질 인 flagellin14 또는 내인성 식물 유도체 단백질 (AtPeps)16과같은 다른 면역 유도체와 함께 사용할 수 있지만 식물 반응성은 식물 반응성에 따라 다르다는 점에 유의해야합니다. 유도자21. 함께, ROS 및 SGI 분석제는 PRR 중재응답의 신속하고 정량적인 평가를 위해 사용될 수 있다.

Protocol

1. 면역 유도 다음 애기장대 잎 디스크에서 ROS 버스트의 검출 식물 성장 및 유지 보수. 발아를 동기화하기 위해, 애기장대 씨앗을 멸균 0.1% 한천 의 1 mL에 약 50 개의 씨앗을 일시 중단하고 3-4 일 동안 4 °C (빛 없음)에 보관하십시오.참고: 야생형 배경 대조군(예를 들어, Col-0)과 높은 및 낮은 면역 출력을 가진 유전형(예: cpk28-1 및 bak1-5)을 계층화하여 내부 대…

Representative Results

돌연변이 cpk28-119,25 및 bak1-517,18 식물은 산화 버스트와 SGI에서 각각 높고 낮은 면역 반응을 가진 유전자형에 대한 예상 결과를 입증하는 데 사용되었습니다. 야생형 배경 대조군(Col-0)을 기준으로 합니다. 투여량 의존적 효과를 평가하기 위해, elf18의 10배 펩타이드 희석 계…

Discussion

이 논문은 애기장대에서패턴 트리거 면역 반응을 분석하는 두 가지 방법을 설명하며, 전문 장비를 사용하지 않고 면역 출력을 평가하는 정량적 접근법을 제공합니다. 조합에서, 패턴 트리거된 ROS 및 SGI는 각각 미생물 지각에 대한 초기 및 후기 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다.

산화 파열 분석법의 주요 제한은 가변성입니다. 완전히 이해되지 않는 이유로 절대 RlUs는…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 실험실에서의 작업은 캐나다의 천연 자원 및 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 발견 프로그램, 캐나다 혁신 재단 존 R. 에반스 리더의 기금 및 퀸즈 대학을 통해 지원됩니다. KS와 IS는 온타리오 대학원 장학금과 NSERC 캐나다 대학원 장학금(CGS-M)의 지원을 받습니다.

Materials

20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589
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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).
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