DREADD制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略
Summary
ここでは、マウスの化学遺伝学を用いて神経活動を慢性的に制御する2つの非侵襲的方法について説明する。点眼剤は、クロザピン-N-酸化物(CNO)を毎日提供するために使用されました。また、飲料水中のCNOの長期投与のための2つの方法についても述べた。慢性神経制御のためのこれらの戦略は、動物のストレスを軽減する最小限の介入を必要とします。
Abstract
化学遺伝学的戦略は、神経活動の遠隔制御のための信頼性の高いツールとして登場しています。これらの中で、デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、現代の神経科学で使用される最も人気のある化学遺伝学的アプローチとなっています。ほとんどの研究は、単一の食後性注射を使用してリガンドクロザピン-N-オキシド(CNO)を提供します, これは、標的ニューロン集団の急性活性化/阻害に適しています.しかし、DREADD制御ニューロンの慢性変調のための戦略のほんの一例は、その大半は外科的介入を必要とする送達システムの使用に依存している。ここでは、ライガンドCNOを送り出してマウスの神経集団を慢性的に操作するための2つの非侵襲的な戦略について展開する。CNOは、反復的な(毎日)点眼薬を使用するか、または動物の飲料水を通して慢性的に投与した。これらの非侵襲的なパラダイムは、CNO治療全体を通じて持続するデザイナー受容体の堅牢な活性化をもたらす。ここで説明する方法は、神経活動の慢性DREADD媒介制御の代替手段を提供し、侵襲性の低いCNO送達方法に焦点を当てて、自由に動く動物の行動を評価するように設計された実験に役立つ可能性がある。
Introduction
神経科学の分野における技術的進歩により、科学者は特定の神経集団の活動を正確に特定し、制御することができました 1.これは、ニューロン回路の基礎と動物の行動への影響をよりよく理解するのに貢献しているだけでなく、確立されたドグマ2、3を改訂する。これらの新しいツールの中で、光遺伝学的および化学遺伝学的戦略は、発見の質だけでなく、実験が考案され、設計される方法にも大きな影響を与えました 4.本原稿では、工学的受容体リガンド戦略を用いてニューロンの活性化を制御するための化学遺伝学的戦略に焦点を当てる。デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、Roth 20165によってレビューされたニューロン活動の遠隔制御のための最も人気のある化学遺伝学的ツールの1つを表します。DREADDsは、不活性リガンド、クロザピン-N-オキシド(CNO)6によって特異的に活性化される修飾されたムスカリン性アセチルコリン受容体を利用する。
ほとんどの研究は、急性の方法でエンジニアリングされた受容体の活性化の投与量とタイミングを効果的に制御する経皮内注射(i.p.)注射によって投与されるCNOを使用します。しかし、反復的または慢性的なDREADD活性化が必要な場合、複数のi.p.注射の使用は不可能になる。この問題に対処するために、移植されたミニポンプ7および頭蓋内カニューラス8、9を含む慢性CNO送達のための異なった戦略が報告されている。異なる範囲に、これらすべての戦略は、動物のストレスおよび痛みを引き起こし、また、テストされる行動応答に直接影響を与えることができる外科的介入を必要とする11。ここでは、慢性CNO送達に対する3つの非侵襲的戦略について述述する。
この目的のために、マウスは、リガンドCNOによって活性化されると、破裂状の発射につながる興奮性M3ムスカリン受容体(hM3Dq)の工学バージョンをコードするアデノ関連ウイルス(AAV)を海馬に立体的に注入した。ニューロン6.CNOを含む単一の点眼剤が効果的にDREADD発現ニューロン12の堅牢な活性化を引き出すことができることが以前に示された。ここでは、点眼薬の反復的な送達のための改変方法について説明する。デザイナー受容体の慢性的かつ持続的な制御を達成するために、次に飲料水を介してマウスにCNOを提供する非侵襲的な戦略について説明する。最後に、制限された時間枠の間に飲料水でCNOを提供するための代替パラダイムについて説明します。マウスの運動活性は、飲酒行動および甘いカロリー溶液の消費と同様に、主に光/暗いサイクル13、14の暗い部分に制限される。そこで、スクロースに対するマウスの好みに基づくプロトコルを採用した。AAV感染細胞における即時早期遺伝子c-Fosの誘導を測定することにより、ニューロン活性化12、15の読み出しとして、これらのCNO送達戦略がDREADD制御ニューロンを長期間にわたって強く活性化することがわかった。期間。
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDsは、ニューロン活動を遠隔操作する一般的で効果的なアプローチとして登場しました 17.CNO 配信の代替戦略の設計は、特定の実験設定で使用できるオプションのスペクトルを大幅に増加します。さらに、CNOの配信のための非侵襲的な戦略は、動物の健康に直接影響を与えることができる有害な副作用を減らすことによって、結果の潜在的な誤解を最小限に抑えます。こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立精神衛生研究所(ZIA MH002964-02)の内部研究プログラムによって支援されました。NIMH IRPげっ歯類行動コア(ZIC MH002952)のサポートに感謝します。
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
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