Fysiologisk, aktiveres lugtstof receptorer af lugtstof molekyler inhaleret i fasen for damp. Dog anvender mest in vitro-systemer flydende fase lugtstof stimulation. Vi præsenterer her, en metode, der giver mulighed for real-time in vitro-overvågning af lugtstof receptor aktivering efter lugtstof stimulation i vapor fase.
Olfaktoriske perception begynder med samspillet mellem duftstoffer med lugtstof receptorer (eller) udtrykt af olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN). Lugt anerkendelse følger en kombinatorisk kodning ordningen, hvor en OR kan aktiveres ved et sæt af Duftenes og én lugtstof kan aktivere en kombination af ORs. Gennem sådanne kombinatorisk kodning, kan organismer registrere og skelne mellem et utal af flygtige lugt molekyler. En lugt ved en given koncentration kan således betegnes ved en aktivering mønster af ORs, der er specifikke for hver lugt. I forstand, revner de mekanismer, som hjernen bruger til at opfatte lugt kræver forståelse lugtstof-OR interaktioner. Dette er grunden til, at Fællesskabets lugtesansen er forpligtet til at “de-orphanize” Disse receptorer. Konventionelle in vitro-systemer anvendes til at identificere lugtstof- eller interaktioner har udnyttet kvægbruget celle medier med lugtstof, som er forskellig fra den naturlige påvisning af lugte via damp Duftenes opløsning i næseslimhinden før interagere med ORs. Her, beskriver vi en ny metode, der giver mulighed for tidstro overvågning af OR aktivering via damp-fase duftstoffer. Vores metode er baseret på måling lejr frigivelse af luminescence ved hjælp af Glosensor assay. Det broer nuværende huller mellem in vivo og in vitro-metoder og danner grundlag for en biomimetiske flygtige kemiske sensor.
Lugtesansen giver mulighed for terrestriske dyr til at interagere med deres flygtige kemiske miljø til kørsel adfærd og følelser. Fundamentalt, lugt afsløring proces begynder med den første interaktion af lugtstof molekyler med det olfaktoriske system, på niveauet af lugtstof receptorer (ORs)1. I pattedyr udtrykkes ORs individuelt i olfaktoriske sensoriske neuroner (OSNs) beliggende i Lugtepithelet2. De tilhører familien G-protein koblet receptor (GPCR) og mere præcist den rhodopsin-lignende undergruppe (også kaldet klasse A). ORs par med den stimulerende G protein Golf hvis aktivering fører til cAMP produktion efterfulgt af åbningen af cykliske nukleotid gated-kanaler og generation af handling potentialer. Det er accepteret, at en lugt percept bygger på et bestemt mønster af aktiverede ORs3,4 og derfor lugt anerkendelse følger en kombinatorisk kodning ordningen, hvor en OR kan aktiveres ved et sæt af Duftenes og én lugtstof kan aktivere en kombination af ORs. Og gennem sådanne kombinatorisk kodning, det er postuleret at organismer kan registrere og skelne mellem et utal af flygtige lugt molekyler. En af nøglerne til forståelsen af hvordan lugt opfattes er at forstå, hvordan og hvilke ORs er aktiveret af en given lugt.
I et forsøg på at belyse lugtstof- eller interaktioner, in vitro-funktionelle assays har spillet en væsentlig rolle. Identifikation af agonist lugtende ligander for sjældne ORs (OR nedtrapning orphanization) har været en meget aktiv inden for de sidste tyve år, ved hjælp af forskellige in vitro ex vivo og in vivo funktionelle assays5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
In vitro assay systemer er bedst egnet til den detaljerede funktionelle karakterisering af ORs, herunder identifikation af funktionelle domæner og kritisk rester af ORs, såvel som potentielle ingeniørmæssige anvendelser. Dog, yderligere udvikling af værdifulde in vitro-systemer til ORs har været en udfordring, dels på grund af vanskeligheder med dyrkningsbaserede OSNs og funktionelle udtryk af ORs i heterolog celler. Den første udfordring var at fastlægge protokoller, der er tilladt for celle overflade udtryk for funktionelle ORs i kortlægningen af lugtstof-OR interaktioner. En række uafhængige grupper har udnyttet forskellige tilgange5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Et af de tidligste resultater blev foretaget af Krautwurst et al. i markeret N-terminalen af ORs med en forkortet sekvens af rhodopsin (Rho-tag) og observeret en forbedret overflade udtryk i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler13. Ændringer til koden knyttet til OR sekvens er stadig en sti udforskes for at forbedre OR udtryk og funktionalitet19,21. Saito mfl. derefter identificeret receptor-transport protein 1 (RTP1) og RTP2, som letter OR handel. 22 en kortere version af RTP1, kaldet RTP1S, har også vist sig at være endnu mere effektiv end den oprindelige protein23. Udviklingen af en cellelinje (Hana3A), som stabilt udtrykker Golf, REEP1, RTP1 og RTP2 24, kombineret med brugen af cyklisk adenosin fra (cAMP) journalister har muliggjort identifikation af lugtstof-OR interaktioner. Den mekanisme, hvormed RTP receptorgruppen af proteiner fremmer celle overflade udtryk af ORs stadig skal fastlægges.
En advarsel af disse etablerede metoder er at de er afhængige af lugtstof stimulation i flydende fase, hvilket betyder at Duftenes pre opløses i en stimulation medium og stimulere cellerne ved at erstatte mediet. Dette er meget forskellige fra de fysiologiske tilstande hvor lugtstof molekyler nå Lugtepithelet i vapor fase og aktivere ORs ved opløsning i næseslimhinden. For at mere ligner fysiologisk relevante stimulus eksponering, Sanz et al.20 foreslås en analyse baseret på vapor stimulation ved at anvende en dråbe af lugtstof løsning at hænge under indersiden af plastfolie placeret på toppen af celle brønde. De indspillede calcium svar ved at overvåge fluorescens intensitet. Denne metode var først til at bruge air-fase lugtstof stimulation, men det tillade ikke en stor screening af OR aktivering.
Her, udviklet vi en ny metode, der muliggør real-time overvågning af in vitro-OR aktivering via damp fase lugtstof stimulation af Glosensor assay (figur 1). Denne analyse har været anvendt tidligere i forbindelse med flydende lugtstof stimulation18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. luminometrisk overvågning kammer er først ekvilibreres med forstøvet lugtstof før pladen læsning (figur 1A). Lugtstof molekyler er derefter solvated i bufferen, badning Hana3A celler, der udtrykker eller interesse, RTP1S og Glosensor proteiner (figur 1B). Hvis lugtstof er en agonist i regionerne, vil eller skifte til en aktiveret kropsbygning og binde Golf, aktivering adenylyl cyclase (AC) og i sidste ende medføre lejr niveauer til at stige. Denne stigende cAMP vil binder til og aktivere Glosensor proteinet til at generere luminescence katalysere luciferin. Denne luminescence registreres derefter af en luminometrisk og muliggør OR aktivering overvågning. Denne metode er af stor interesse i forbindelse med OR deorphanization som det bringer in vitro-systemer tættere på den fysiske opfattelse af lugte.
Opfattelsen af lugt er grundlæggende afhængig af aktivering af ORs. Dermed, forståelse af deres funktionalitet er krævede hen til knæk de komplekse mekanismer, som hjernen bruger til at opfatte sin flygtige kemiske miljø. Men forståelsen af denne proces er blevet hæmmet af vanskelighederne med at etablere en robust metode til at screene OR repertoire for funktionalitet mod Duftenes in vitro-. Celle overflade og heterolog udtryk af ORs er blevet delvist løst ved oprettelsen af mærket receptorer<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (DC014423 og DC016224) og Defense Advanced Research projekt agenturet RealNose projektet. YF boede på Duke University med finansiel støtte fra JSP’ER Program til at fremme strategiske internationale net skal fremskynde omsætning af talentfulde forskere (R2801). Vi takker Sahar Kaleem til redigering af manuskriptet.
0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C |
100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C |
centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum – store at -20°C |
GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C |
Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C |
Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants – store at room temperature |
Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C |
pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C |
phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
RTP1S | H. Matsunami lab | – | 100 ng/µL plasmid – store at 4°C |