Excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi att effektivt diskriminera fluorescens signaler

Summary

Spectral Imaging har blivit en pålitlig lösning för identifiering och separation av multipla fluorescenssignaler i ett enda prov och kan lätt urskilja signaler av intresse från bakgrund eller autofluorescence. Excitation-scanning Hyperspektrala Imaging förbättrar denna teknik genom att minska den nödvändiga bilden förvärvs tid samtidigt öka signal-brus-förhållande.

Abstract

Flera tekniker förlitar sig på detektion av fluorescenssignaler för att identifiera eller studera fenomen eller för att belysa funktioner. Separation av dessa fluorescenssignaler var bevisat besvärliga fram till tillkomsten av Hyperspektrala avbildning, där fluorescens källor kan separeras från varandra samt från bakgrunds signaler och autofluorescence (ges kunskap om deras spektrala signaturer). Men traditionella, utsläpp scanning Hyperspektrala avbildning lider av långsamma förvärvs tider och låg signal-brus-förhållanden på grund av den nödvändiga filtreringen av både excitation och utsläpp ljus. Det har tidigare visats att excitation-scanning Hyperspektrala Imaging minskar den nödvändiga förvärvs tiden samtidigt öka signal-brus-förhållandet av förvärvade data. Med hjälp av kommersiellt tillgänglig utrustning beskriver detta protokoll hur man monterar, kalibrerar och använder en excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi system för separation av signaler från flera fluorescenskällor i ett enda prov. Även om det är mycket tillämpligt på mikroskopisk avbildning av celler och vävnader, kan denna teknik också vara användbar för alla typer av experiment som utnyttjar fluorescens där det är möjligt att variera excitation våglängder, inklusive men inte begränsat till: kemisk avbildning, miljötillämpningar, ögonvård, livsmedelsvetenskap, forensisk vetenskap, medicinsk vetenskap och mineralogi.

Introduction

Spektralavbildning kan utföras på olika sätt och refereras till av flera termer^1,2,3,4. I allmänhet avser spektral avbildning data som erhållits i minst två rumsliga dimensioner och en spektraldimension. Multispektrala och Hyperspektrala avbildning kännetecknas oftast av antalet våglängdsband eller om spektralbanden är sammanhängande¹. För detta program definieras Hyperspektrala data som spektrala data som erhållits med sammanhängande våglängd band uppnås genom avstånd av centrum våglängder inte mindre än halva full bredd på halva Max (FWHM) av varje bandpass filter som används för excitation (dvs 5 nm mittvåglängdsavstånd för bandpass-filter med 14-20 nm bandbredder). Den sammanhängande karaktären hos data banden möjliggör en översampling av DataSet, vilket säkerställer att Nyquists kriterier uppfylls vid provtagning av spektraldomänen.

Hyperspektrala Imaging utvecklades av NASA under 1970-och 1980-talen i samband med den första LANDSAT Satellite^5,6. Att samla in data från flera sammanhängande spektralband tillät uppkomsten av ett utstrålande spektrum av varje pixel. Identifiering och definition av strålningsspektrat av enskilda komponenter gjorde det möjligt att inte bara detektera ytmaterial genom sina karakteristiska spektra, utan också tillåtet för avlägsnande av mellanliggande signaler, såsom variationer i signalen på grund av atmosfäriska förhållanden. Konceptet att detektera material med hjälp av deras karakteristiska spektra tillämpades på biologiska system i 1996 när schröck et al. använde kombinationer av fem olika fluoroforer och deras kända spektra för att särskilja märkta kromosomer i en process som kallas spektralkaryotypning⁷. Denna teknik utarbetades på 2000 av Tsurui et al. för fluorescens Imaging av vävnadsprover, med hjälp av sju fluorescerande färgämnen och singular värde nedbrytning för att uppnå spektral separation av varje pixel i linjära kombinationer av spektra i referens bibliotek⁸. Liknar deras fjärranalys motsvarigheter, kan bidraget från varje känd fluorophore beräknas från Hyperspektrala bilden, ges a priori information om spektrumet av varje fluorophore.

Hyperspektral avbildning har också använts inom jordbruksområdet⁹, astronomi¹⁰, biomedicin¹¹, kemisk avbildning¹², miljötillämpningar¹³, ögonvård¹⁴, Food Science¹⁵, forensisk vetenskap^16,17, medicinsk vetenskap¹⁸, mineralogi¹⁹, och övervakning²⁰. En viktig begränsning av nuvarande fluorescensmikroskop Hyperspektrala avbildningssystem är att standarden Hyperspektrala avbildningsteknik isolerar fluorescens signaler i smala band av 1) först filtrering excitation ljus för att kontrollera prov excitation, sedan 2) ytterligare filtrering avges ljus för att separera fluorescensutsläpp i smala band som senare kan separeras matematiskt²¹. Filtrering både excitation belysning och utsända fluorescens minskar mängden tillgänglig signal, vilket sänker signal-brus-förhållande och kräver långa förvärvs tider. Den låga signalen och långa förvärvs tider begränsar tillämpligheten av Hyperspektrala avbildning som ett diagnostiskt verktyg.

En bildbehandlings-modalitet har utvecklats som utnyttjar hyperspektral avbildning men ökar den tillgängliga signalen, vilket minskar den nödvändiga förvärvs tiden^21,22. Denna nya modalitet, kallad excitation-scanning Hyperspektrala avbildning, förvärvar spektrala bilddata genom att variera excitation våglängd och samla ett brett spektrum av utsläppt ljus. Det har tidigare visats att denna teknik ger order av magnitud ökar i signal-brus-förhållande jämfört med utsläpps skanning tekniker^21,22. Ökningen av signal-brus-förhållandet beror till stor del på den breda bandpass (~ 600 Nm) av utsläpps ljus detekteras, medan specificitet tillhandahålls genom filtrering endast excitation ljus i stället för fluorescensutsläpp. Detta gör att alla avgivna ljus (för varje excitation våglängd) för att nå detektorn²¹. Dessutom kan denna teknik användas för att diskriminera autofluorescence från exogena etiketter. Dessutom minskar förmågan att minska förvärvs tiden på grund av ökad detekterbar signal risken för foto blekning samt möjliggör spektrala skanningar till en förvärvsfrekvens som är godtagbar för spektral video avbildning.

Målet med detta protokoll är att fungera som en datainsamling guide för excitation-scanning Hyperspektrala Imaging mikroskopi. Dessutom ingår beskrivningar som hjälper till att förstå ljusbanan och hårdvaran. Beskrivs också är genomförandet av öppen källkod för en excitation-scanning Hyperspektrala Imaging Mikroskop. Slutligen finns beskrivningar för hur man kalibrerar systemet till en NIST-spårbar standard, justerar program-och maskinvaruinställningar för korrekta resultat och avblandar den upptäckta signalen i bidrag från enskilda komponenter.

Protocol

1. apparat uppsättning Ljuskälla: Välj en bredbandspektral ljuskälla med hög uteffekt och hög kollimation (en 300 W XE Arc-lampa användes för dessa studier). Slutare (tillval): Lägg till en slutare till den optiska banan för att reducera foto blekning för fotografering med tidsförlopp. Avstämbara filtersystem: införliva en mekanisk trimmontering och Thin-Film avstämbara filter (tftf) inställd för att möjliggöra önskad våglängd-justerbar excitation Range (t. ex., 360-485…

Representative Results

Flera viktiga steg från detta protokoll är nödvändiga för att säkerställa insamling av data som är både korrekt och saknar avbildning och spektrala artefakter. Hoppa över dessa steg kan resultera i data som verkar betydande men inte kan verifieras eller återges med andra spektrala avbildningssystem, vilket effektivt omintetgör alla slutsatser som gjorts med nämnda data. Chief bland dessa viktiga steg är korrekt spektrala output korrigering (avsnitt 3). Korrektionsfaktorn kom…

Discussion

Den optimala användningen av excitation-scanning Hyperspektrala Imaging set-up börjar med byggandet av ljusbanan. I synnerhet val av ljuskälla, filter (tunable och Dichroic), filter växling metod och kamera bestämma tillgängliga spektralområdet, möjlig skanningshastighet, detektor känslighet, och rumsliga provtagning. Mercury Arc-lampor erbjuder många excitation våglängd toppar men ger inte en platt spektralutgång och kommer att kräva betydande signal reducering vid utgången toppar för att korrigera spekt…

Materials

Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output