이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.
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이 논문에서
요약
초록
심근 재생을 위한 세포 치료 효과 향상에 있는 결정적인 요인은 세포 생착 비율을 안전하고 효율적으로 증가하는 것입니다. Y-27632는 로-관련, 코일 코일 함유 단백질 키나아제(RhoA/ROCK)의 매우 강력한 억제제이며 해리-유도 세포 세포 세포 사멸(anoikis)을 예방하는 데 사용됩니다. 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs+RI)에대한 Y-27632 전처리가 급성 심근경색(MI)의 마우스 모델에서 세포 생착율 향상을 초래한다는 것을 입증한다. 여기서, 우리는 Y-27632를 가진 hiPSC-CM 분화, 정화 및 세포 전처리의 완전한 절차, 뿐만 아니라 생성된 세포 수축, 칼슘 과도 측정 및 마우스 MI 모델로의 이식에 대해 설명합니다. 제안된 방법은 세포 생착 속도를 현저하게 증가시키는 간단하고 안전하며 효과적이며 저렴한 방법을 제공한다. 이 방법은 세포 이식 효율을 더욱 향상시키기 위해 다른 방법과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 심장 질환의 메커니즘에 대한 연구에 유리한 기반을 제공합니다.
서론
줄기 세포 기지를 둔 치료는 MI 1에 기인한 심장손상을 위한 처리로 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 차별화된 hiPSCs의 사용은 hiPSC-CMs2의 무한한 공급원을 제공하고 획기적인 치료법의 신속한 발전을 위한 문을 엽니다. 그러나, 이식된 세포의 심각하게 낮은 생착 율의 도전을 포함하여 치료 번역에 많은 한계가 남아 있습니다.
트립신과 세포를 해리하는 것은 anoikis를시작합니다 3, 이는 이 세포가 허혈성 심근과 같은 가혹한 환경에 주입되면 가속되는, 저산소 환경은 세포 죽음을 향한 과정을 가속화. 나머지 세포의, 큰 비율은 혈 류로 이식 사이트에서 밖으로 세척 하 고 주변에 걸쳐 확산. 주요 apoptotic 경로 중 하나는 RhoA/ROCK통로 4. 이전 연구에 기초하여, RhoA/ROCK통로는 세포 기능 장애7,8을담당하는 액틴 세포골격 조직5,6을조....
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프로토콜
이 연구결과의 모든 동물 절차는 버밍엄에 있는 알라바마 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 건강 실험실 동물 관리 및 사용 지침의 국립 학회 (NIH 간행물 No)에 근거를 두어 85-23).
1. 문화미디어및문화판의준비
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중간 준비
- hiPSC 배지의 경우, 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 기저 배지 (재료표1) 및 hPSC 5x 보충제 의 100 mL의 400 mL를 혼합; 혼합물을 4 °C에 보관하십시오.
- RPMI 1640/B27 마이너스 인슐린(RB-) 매체의 경우, RPMI 1640 의 500 mL과 B27 보충제의 10 mL을 혼합하여 인슐린을 빼내.
- RPMI 1640/B27(RB+) 매체의 경우, RPMI 1640, B27 보충제 10 mL, 페니실린-스트렙토마이신(펜 스트렙) 항생제 5mL를 혼합합니다.
- 정화 매체16의경우, 무포도당 RPMI 1640, B27 보충제 10 mL, 펜 스트렙 항생제 5 mL 및 DL-젖산 나트륨 용액 1,000 μL (최종 농도 4 mM)을 혼합하십시오. ....
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결과
본 연구에 사용된 hiPSC-CM은 루시퍼라제 리포터 유전자를 가진 인간 기원으로부터 유래되었다; 따라서 생체 내 이식 된 세포의 생존율은 생물 발광 이미징 (BLI)17 (도 1A,B)에 의해 검출되었다. 조직학적 심장 절편을 위해, 인간 특이적 심장 트로포닌 T(hcTnT) 및 인간 핵 항원(HNA) 이중 양성세포는 이식된 hiPSC-CM으로 분류하였다(그림 1C). 두 결과 모두 Y-27632 전처리가 세포 생착 속도를 현저하게 향상시켰습니다. hiPSC-CM+RI 군의 루시퍼라아제 활성은 이식 후 3일, 7일 및 28일에 대략 6배 증가하였으며, hiPSC-CM-RI 군의 그것과 비교하였다(도 1B).
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토론
이 연구의 주요 단계는 순수한 hiPSC-CM을 획득하고, Y-27632 전처리를 통해 hiPSC-CM의 활성을 개선하고, 마지막으로 정확한 양의 hiPSC-CM을 마우스 MI 모델로 이식하는 것을 포함합니다.
여기서 해결된 주요 이슈는 우선 포도당 없는 정제 방법19를 최적화하고 새로운 효율적인 정화 시스템을 구축했다는 것입니다. 시스템 절차에는 세포 해리 효소를 적용하고, 젤라틴 코팅 플레이트에 세포를 이식하고, 반응 후 24 시간 동안 중화 배지에서 세포를 배양하고, 이식 전에 세포의 소화 시간을 최소화하는 것이 포함되었습니다. 그 중 순수한 심근 세포를 얻는 동안 세포의 가장 높은 활성을 달성하기 위해 수행되었다.
둘째, 우리는 세포 주입 전에 12 시간에서 Y-27632를 가진 hiPSC-CM의 전처리에 정교하게 했습니다. anoikis는 일반적으로 세포 '접착 단백질의 변형에 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 조셉 C. 우 박사에게 감사드립니다 (스탠포드 대학) 친절하게 Fluc-GFP 구조와 박사 얀웬 리우 우수한 기술 지원을 제공. 이 연구는 국립 보건원 에서 지원되는 HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (J.Z.), HL121206A1 (L.Z.), R56 보조금 HL142627 (미국 하트 협회) 16SDG30410018, 버밍엄 학부 개발 보조금에서 앨라배마 대학 (W.Z.에).
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재료
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| Reagent | |||
| Accutase (줄기세포 분리 용액) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 마이너스 인슐린 | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM(1x), 고포도당, HEPES, 페놀 레드 | 없음 Thermofisher | 20163029 | |
| 소 태아 혈청 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (칼슘 지시약) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| 무포도당 RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | 줄기세포 기술 | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II Cytoskeleton (Rho activator II | Cytoskeleton | )CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
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| 소프트웨어 | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
참고문헌
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C.
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재인쇄 및 허가
