يتيح اختبار التحليل متعدد الجوانب المتغيرة (MLVA) الذي تم عرضه هنا، نماذج جينية عالية الدقة وغير مكلفة وقوية ومحمولة للبكتيريا المسببة للأمراض في الرسينيا روكري. بدءا من الثقافات النقية، والقول باستخدام PCR متعددة والكهربائي الشعرية لإنتاج عشرة موضع MLVA ملامح لتطبيقات المصب.
Yersinia ruckeri هو ممرض مهم من سمك السلمون المستزرع في جميع أنحاء العالم، ولكن لم تكن هناك أدوات بسيطة مناسبة للتحقيقات الحيوانية (تتبع العدوى، وما إلى ذلك) من هذه البكتيريا. ولذلك، تم تطوير اختبار تحليل متعدد الأرقام المتغيرة للتكرار جنبا إلى جنب (MLVA) كأداة يسهل الوصول إليها ولا لبس فيها للكتابة الجينية عالية الاستبانة للعزلات المستردة. لاختبار MLVA المعروضة هنا، يتم استخراج الحمض النووي من عينات المستزرعة Y. ruckeri عن طريق الخلايا البكتيرية المغلية في الماء، تليها استخدام supernatant كقالب لPCR. يتم توزيع أزواج التمهيدي التي تستهدف عشرة مواقع ذات عدد متغير من الأرقام المتداخلة (VNTR)، تتخللها جميع أنحاء جينوم Y. ruckeri، بالتساوي بين اثنين من ردود الفعل PCR خمسة بلبل تعمل في ظل ظروف ركوب الدراجات متطابقة. يتم وضع علامة التمهيديات إلى الأمام مع أي من الأصباغ الفلورية الثلاثة. بعد تأكيد amplicon بواسطة الكهربائي هلام، يتم تخفيف منتجات PCR وتخضع لالكهربائي الشعرية. من الملامح الكهربائي الناتجة، القمم التي تمثل كل من موضع VNTR تسمى الحجم وتستخدم لحساب VNTR تكرار التهم في silico. ثم يتم استخدام التشكيلات الجانبية MLVA المكونة من عشرة أرقام لإنشاء أشجار تمتد الحد الأدنى مما يتيح التقييم الحيواني عن طريق تحليل الكتلة. ويمكن مقارنة بيانات النواتج المحمولة للغاية، في شكل ملفات تعريف ية رقمية من نوع MLVA، بسرعة عبر المختبرات ووضعها في سياق زمني مبجّل. يمكن إكمال الإجراء بأكمله من المستعمرة المستزرعة إلى التقييم الحيواني للزوولوجيلمدة لمدة تصل إلى 48 Y. ruckeri isolates في غضون يوم عمل واحد.
Yersinia ruckeri، وهي بكتيريا سلبية غرام وعضو في عائلة Yersiniaceae ، يسبب داء الرسيس في الأسماك السالمونية المستزرعة في جميع أنحاء العالم1. يتم تشخيصه بسهولة من الأسماك المصابة عن طريق الزراعة على أنواع كثيرة من وسائل الإعلام أجار، ولكن حتى وقت قريب، لم يكن معروفا إلا القليل فيما يتعلق بالهيكل السكاني وعلم الحيوان من Y. ruckeri في جميع أنحاء العالم وفي الموائل المختلفة (الأنواع المضيفة، وما إلى ذلك). إن نظم الأنماط المصلية القائمة لـ Y. ruckeri غير متسقة، وتفتقر إلى التوافق المتبادل، وتوفر دقة وبائية منخفضة. وقد أجريت بعض الدراسات الجزيئية على البكتيريا، وتستخدم تقنيات مثل متعدد اللولوس تسلسل الكتابة (MLST)، نبض المجال هلام الكهربائي (PFGE)أو تسلسل الجينوم الكامل (WGS) تحليل 2،3،4 ،5. ومع ذلك، MLST لا توفر دقة عالية بما فيه الكفاية لتتبع العدوى الروتينية، في حين PFGE هو العمل تطالب وتنتج النتائج التي ليست محمولة بسهولة عبر المختبرات. وفي حين أن تحليل الفريق العامل سيوفر حلا ً نهائياً تقريباً، فإن إنشاء وتنفيذ هذه التحليلات من شأنه أن يُحدد مسبقاً القدرات التقنية وقدرات المعلوماتية الأحيائية التي لا تزال مقصورة على عدد صغير نسبياً من المختبرات.
يمثل التحليل المتكرر للتكرار (MLVA) أداة كتابة جزيئية بسيطة يسهل الوصول إليها، والتي تقدم دقة وراثية في بعض الحالات مطابقة تقريباً لدقة تحليل WGS6و7. وتستند هذه التقنية إلى تكرار تباين الأرقام في موضع محدد من حيث الأرقام المتغيرة والمكررة (VNTR)، مما يؤدي إلى بيانات إخراج قابلة للنقل إلى حد كبير، مما يجعل المقارنة بين المعزولات الشخصية نحو قواعد البيانات عبر الإنترنت وعبر المختبرات مباشرة. على الرغم من أن MLST لا يزال المعيار الذهبي للكتابة الوبائية للعديد منمسببات الأمراض البكتيرية، وعدد متزايد من الدراسات تحديد قوة تمييزية أعلى بكثير من MLVA 8،9،10. كما تم نشر العديد من البروتوكولات التي تستهدف البكتيريا المسببة للأمراض السمكية، مثل فرانسيسيلا نوماتونينسيس، إدواردسيلا بيسكيدا ورينيباكتريوم سالمونيناروم11،12، 13.
بروتوكول MLVA عشرة loci المقدمة هنا، والتي شكلت مؤخرا الأساس لدراسة سكانية واسعة النطاق Y. ruckeri 14، ينطوي على استخراج الحمض النووي من المستعمرات المزروعة أجار، متعددة PCR والكهربائي الشعرية (CE)، تليها المصب في تطبيقات silico. وبالنسبة لكل عزل تم فحصه، يتم تشغيل اثنين من وحدات فينول الخماسي الكلور متعددة المضاعفات، وكلاهما يحتوي على خمسة أزواج أولية تحمل علامة فلورسنت (6FAM أو NED أو VIC) يستهدف كل منها مناطق VNTR فردية، بالتوازي في ظل ظروف متطابقة. بعد التحقق من amplicons PCR بواسطة الكهربائي هلام (GE)، يتم تخفيف منتجات PCR قبل تحليل CE، والقمم التي تمثل موضع VNTR المعنية هي الحجم يسمى من ملفات الكهربائي الناتجة. جنبا إلى جنب مع الصيغ الخاصة بالمكان التي تمثل الاختلافات الطفيفة، وتسلسل محددة في أنماط الهجرة CE، ثم يتم استخدام VNTR CE حجم المكالمات لحساب VNTR تكرار التهم التي يتم ربطها في ملامح MLVA من عشرة أرقام. وتستخدم هذه كمدخلات للتقييمات الحيوانية الحيوانية (على سبيل المثال، عن طريق تحليل الكتلة في الحد الأدنى من الامتداد شجرة (MST) الرسومات التخطيطية).
وقد بدت كل من الـ PCRs المتعددة المعروضة هنا قوية نسبياً في مواجهة رداءة نوعية الحمض النووي القالب، ولكن لوحظ عدم تضخيم PCR في بعض الأحيان عند استخدام قوالب ذات تركيزات عالية للغاية من الحمض النووي. وقد تم حل هذه المسائل بسهولة عن طريق تخفيف القوالب قبل PCR. ويمكن أيضاً استخدام أساليب أخرى لاستخراج الحمض النووي غير تلك المستخدمة هنا (مثل المجموعات التجارية).
على الرغم من أنه من المتوقع خمسة amplicons من كل رد فعل PCR متعددة، لا ينبغي دائماً توقع خمسة نطاقات مميزة بصرياً من جنرال إلكتريك، كما أن بعض (وصفت بشكل مختلف) VNTR loci داخل نفس رد الفعل لها نطاقات حجم متداخلة. ويمكن تقصير وقت تمديد PCR النهائي من 60 دقيقة إذا لزم الأمر، ولكن من المرجح أن يؤدي إلى زيادة حدوث القمم الانقسام في المخططات الكهربائية CE اللاحقة (انظر أدناه). وتجدر الإشارة إلى أن الغرض من خطوة جنرال إلكتريك هو فقط للتحقق النوعي من amplicons PCR، يمكن تعديل وقت التشغيل والجهد و / أو وصفة هلام كما هو مفضل. وإذا لاحظت جنرال إلكتريك نطاقات ضعيفة بوجه خاص، فقد يكون من المستصوب تقليل عامل التخفيف من تلك العينات قبل CE.
في حين تم تشغيل بروتوكول CE الموضح هنا على جهاز كهربائي شعري تجاري محدد (انظر جدولالمواد)، قد يكون لأنظمة CE مختلفة متطلبات عينة مختلفة، والتي قد تؤدي بدورها إلى إدخال بعض التعديلات على البروتوكول . راجع دليل الشركة المصنعة لنظام CE المعنية للحصول على تعليمات حول الكواشف المناسبة / المعدات، والمعايرة وما إلى ذلك لتحليل الأجزاء. وهناك أيضا احتمال أن أنماط التنقل amplicon منحازة لوحظ خلال CE قد تختلف, نسبيا, عبر أنظمة CE و / أو الآلات, كما تم توثيقها سابقا لبروتوكولات MLVA الأخرى15,16. إذا حدث إلى حد حيث يتم تأثر عمليات تكرار VNTR النهائية (تقريبًا)، فهذا يعني أنه يجب إعادة معايرة المتغيرات الخاصة بالموقع s وi (الجدول1)،المستخدمة لتحديد عدد تكرار VNTR. وهذا ينطوي على الانحدار الخطي على المؤامرات مقارنة أحجام تسلسل دقيقة مقابل حجم CE المكالمات، كما هو موضح من قبل Gulla وآخرون 201814.
القمم المنقسمة وقمم التأتأة، وكلاهما من القطع الأثرية المعروفة في CE القائم MLVA كتابة17،يمكن ملاحظتها في تخطيط البهروهرخلال أثناء استدعاء الحجم (الشكل4). في حين ينبغي تجاهل قمم التأتأة، يجب اختيار الذروة الأطول باستمرار للتطبيقات المصب في حالة القمم المقسمة مفصولة بزوج أساسي واحد. وعلاوة على ذلك، فإن القمم الغائبة التي تشير إلى عدم وجود موضع VNTR معين نادرة، ولكن قد تحدث، وفي هذه الحالة ينبغي تعيين عدد مكرر من ‘0’. إذا كانت ثقافة البداية التي يتم استخراج الحمض النووي ليست نقية (أي، يحتوي على أكثر من نوع فرعي Y. ruckeri)، يمكن ملاحظة قمم طويلة متعددة المقابلة لأليليس مختلفة من نفس المكان / loci بعد CE. ثم يجب إجراء الزراعة الثانوية من مستعمرات واحدة قبل استخراج الحمض النووي الجديد لإعادة الكتابة.
كما هو مذكور في البروتوكول، يجب أن يتم استخراج الحمض النووي قالب لPCR افتراضيا من الثقافات النقية من Y. ruckeri. ومع ذلك، في حالات قليلة، تم بنجاح كتابة عينات سوائل البيض التي كانت إيجابية بالنسبة لـ Y. ruckeri بواسطة qPCR (Ct-values < 27) بشكل مباشر، دون زراعة مسبقة، باستخدام كمية متزايدة من الحمض النووي الجينومي (المستخرج ة مع مجموعة تجارية) كقالب. وعلى الرغم من أن هذا النهج لم يجر اختباره أو التحقق منه على نطاق واسع، فإنه يشير إلى إمكانية إجراء هذا الفحص من قبل الـ MLVA لفحص المصفوفات البيولوجية المعقدة التي تحتوي على الحمض النووي من مجموعة من الكائنات الحية المختلفة بالإضافة إلى Y. ruckeri.
يمكن إكمال إجراء الكتابة MLVA بأكمله المعروض هنا، من استخراج الحمض النووي إلى التقييم الحيواني، في يوم عمل واحد. ومع ذلك، فإن عدد العينات التي تم فحصها هو في علاقة دون خطية مع الوقت المطلوب لاستخراج الحمض النووي، PCR وCE، وبالتالي فإن الطريقة هي أكثر كفاءة من حيث الوقت عند تشغيل عينات متعددة في وقت واحد. ومع ذلك هذا هو الحال بالنسبة لمعظم الأساليب المستندة إلى المختبر، وكأداة للكتابة الفرعية الوبائية من Y. ruckeri،والجمع بين عالية الدقة والبساطة وقابلية النقل يجعل هذا الاختبار MLVA متفوقة على البروتوكولات المنشورة سابقا4 ،5. كما تم استخدامه للتحقق من الأهمية الوبائية المحدودة للY. ruckeri serotyping14.
من خلال دراسة سكانية شاملة قائمة على MLVA تشمل 484 Y. ruckeri عزل تعافى من مجموعة من الأصول والموائل spatiotime (الأسماك المضيفة، والبيئة، وما إلى ذلك)، فهمنا فيما يتعلق علم الحيوان والسكان تم زيادة هيكل هذا الممرض الأسماك الهامة إلى حد كبير14. ومكّنت كتابة الـ MLVA من تعقب الحيوانات المستنسخة التي تم نشرها عن طريق الإنسان البشري على مدى عقود، ويفترض أن يكون ذلك عن طريق نقل الأسماك، فضلا عن تحديد السلالات المحصورة محليا. وعلاوة على ذلك، في حين أن بعض المجمعات الكلونية للبكتيريا يمكن أن ترتبط بوضوح مع المرض على وجه الخصوص المضيفين الأسماك (سمك السلمون المرقط قوس قزح وسمك السلمون الأطلسي، على التوالي)، والبعض الآخر تم استردادها فقط من المصادر البيئية و / أو الأسماك غير المتأثرة سريريا العينات. وبالتالي، فإن تطبيق هذه الطريقة لا يقتصر على تتبع العدوى فحسب، حيث أنه قد يوفر أيضاً معلومات ذات صلة محتملة، مثل تطوير اللقاحات، وتقييم المخاطر، والحفاظ على الأمن البيولوجي الوطني. وهو يستخدم حاليا ً بشكل نشط في المعهد البيطري النرويجي كأداة للتحقيق في تشخيصات Y. ruckeri في تربية الأحياء المائية النرويجية.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذه الدراسة من الصندوق النرويجي لبحوث المأكولات البحرية، FHF (المشروع رقم 901119 و901505). ونود أن نشكر جميع المساهمين في العزلات البكتيرية والعينات المستخدمة أثناء تطوير الأسلوب.
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |