Multi-geometrisk variabel-antall tandem-gjenta analyse (MLVA) analysen presenteres her muliggjør billig, robust og bærbar høyoppløselig genotyperingteknologi av fisk-patogene bakterien Yersinia ruckeri. Starter fra rene kulturer, analysen sysselsetter multiplex PCR og kapillær elektroforese å produsere ti-Loci MLVA profiler for nedstrøms applikasjoner.
Yersinia ruckeri er en viktig patogen av oppdretts laksefisk over hele verden, men enkle verktøy egnet for epizootiological undersøkelser (infeksjon tracing, etc.) av denne bakterien har manglet. A multi-geometrisk variabel-nummer tandem-gjenta analyse (MLVA) analysen ble derfor utviklet som et lett tilgjengelig og entydig verktøy for høyoppløselig genotyperingteknologi av gjenopprettede isolat. For MLVA analysen presenteres her, DNA er Hentet fra kultivert Y. ruckeri prøver ved å koke bakterielle celler i vann, etterfulgt av bruk av supernatanten som mal for PCR. Primer-parene målretting ti variable-Number tandem-REPEAT (VNTR) Loci, ispedd hele Y. ruckeri Genova, fordeles likt blant 2 5-Plex PCR reaksjoner kjører under identiske sykling forhold. Forward primere er merket med ett av tre fluorescerende fargestoffer. Etter amplicon bekreftelse ved gel elektroforese, er PCR-produktene fortynnet og utsatt for kapillær elektroforese. Fra de resulterende elektroferogrammet profilene er topper som representerer hver av VNTR-Loci, størrelses kalt og ansatt for beregning av VNTR-antall i silisiummangan. Resulterende ti-sifret MLVA profiler blir så brukt til å generere minimum spenner over trær muliggjør epizootiological evaluering av klynge analyse. Den svært bærbare utgangs data, i form av numeriske MLVA profiler, kan raskt sammenlignes på tvers av laboratorier og plassert i en spatiotemporal sammenheng. Hele prosedyren fra kultivert koloni til epizootiological evaluering kan fullføres for opptil 48 Y. ruckeri isolerer innen en enkelt arbeidsdag.
Yersinia ruckeri, en Gram-negativ bakterie og medlem av Yersiniaceae-familien, fører til yersiniose i oppdretts laksefisk over hele verden1. Det er lett diagnostisert fra infiserte fisk ved dyrking på mange typer agar medier, men inntil nylig, lite var kjent om befolkningen struktur og epizootiology av Y. ruckeri over hele verden og i ulike habitater (verts arter, etc.). Eksisterende serotyping systemer for Y. ruckeri er inkonsekvent, mangel gjensidig kompatibilitet og tilbyr lav epidemiologiske oppløsning. Noen molekylær studier på bakterien har blitt gjennomført, ansette teknikker som Multilocus sekvens typing (MLST), pulserende-Field gel elektroforese (PFGE) eller hele-Genova sekvens (WGS) analyse2,3,4 ,5. Imidlertid gir MLST ikke en tilstrekkelig høy oppløsning for rutinemessig infeksjon tracing, mens PFGE er arbeidskrevende og produserer resultater som ikke er lett bærbare på tvers av laboratorier. Mens WGS analyse ville gi en nær ultimate oppløsning, etablering og gjennomføring av slike analyser ville forutsetning tekniske-og bioinformatikk evner som ennå ikke begrenset til et relativt lite antall laboratorier.
Multi-geometriske variable-antall tandem-REPEAT analyse (MLVA) representerer en enkel og lett tilgjengelig molekylær skrive verktøyet, som tilbyr en genetisk oppløsning i noen tilfeller nesten samsvarer med WGS analyse6,7. Teknikken er basert på Gjenta tall variasjon i valgt variabel-nummer tandem-REPEAT (VNTR) Loci, som resulterer i Output data som er svært transportable, noe som gjør sammenligning av profilerte isolerer mot online databaser og på tvers av laboratorier grei. Selv om MLST forblir gullstandarden for epidemiologiske skrive av mange bakterielle patogener, et økende antall studier identifisere en betydelig høyere diskriminerende effekt av MLVA8,9,10. Flere protokoller har også blitt publisert rettet mot fisk-patogene bakterier, slik som Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida og Renibacterium salmoninarum11,12, 13 i år.
Den ti-Loci MLVA protokollen som presenteres her, som nylig dannet grunnlaget for en omfattende Y. ruckeri befolknings studie14, innebærer ekstraksjon av DNA fra agar-DYRKET kolonier, multiplex PCR og kapillær elektroforese (CE), etterfulgt av nedstrøms i silisiummangan applikasjoner. For hver undersøkt isolat, to multiplex PCRene, begge inneholder fem fluorescensmerkete merket primer parene (6FAM, NED eller VIC) hver målretting individuelle VNTR regioner, kjøres parallelt under identiske forhold. Etter verifisering av PCR-amplicons ved gel elektroforese (GE), blir PCR-produktene fortynnet før CE-analysen, og topper som representerer de respektive VNTR-Loci, er størrelse kalt fra de resulterende elektroferogrammet filene. Sammen med geometriske-spesifikke formler regnskap for mindre, sekvens-spesifikke avvik i CE trekk mønstre, er VNTR CE størrelse samtaler deretter ansatt for beregning VNTR gjenta teller som er sammensatt i ti-sifret MLVA profiler. Disse brukes som inn data for epizootiological evalueringer (f.eks. ved klynge analyse i minimum sprednings tre (MST)-diagrammer).
Begge multiplex PCRene presenteres her har dukket opp relativt robust i møte med dårlig mal DNA-kvalitet, men mangelen på PCR forsterkning ble likevel tidvis observert ved bruk av maler med ekstremt høye DNA-konsentrasjoner. Disse problemene ble lett løst ved å fortynne malene før PCR. Andre metoder for DNA-ekstraksjon enn den som er ansatt her kan også brukes (for eksempel kommersielle kits).
Selv om fem amplicons er forventet fra hver enkelt PCR-reaksjon, bør fem visuelt gjenkjennelige bånd ikke alltid forventes fra GE, som noen (annerledes merket) VNTR-Loci innenfor samme reaksjon har overlappende størrelses områder. Den endelige PCR forlengelses tiden på 60 min kan forkortes om nødvendig, men vil sannsynligvis føre til økt forekomst av splitt topper i påfølgende CE-electropherograms (se nedenfor). Ettersom formålet med GE-trinnet bare er for kvalitativ verifisering av PCR-amplicons, kan operasjonstiden, spenningen og/eller gel-oppskriften justeres som foretrukket. Hvis det observeres spesielt svake bånd av GE, kan det være tilrådelig å redusere fortynningsfaktoren for disse prøvene før CE.
Mens CE-protokollen som beskrives her, ble kjørt på et bestemt kommersielt kapillær elektroforese apparat (se tabell over materialer), kan forskjellige CE-systemer ha forskjellige prøve krav, noe som i sin tur vil be noen endringer i protokollen . Se håndboken for den respektive produsenten av CE-systemet for instruksjoner om egnede reagenser/utstyr, kalibrering etc. for fragment analyse. Det er også en mulighet for at de partisk amplicon mobilitets mønstrene observert under CE kan variere, relativt, på tvers av CE-systemer og/eller maskiner, som tidligere har vært dokumentert for andre MLVA protokoller15,16. Hvis det forekommer i en grad der endelige (avrundede) VNTR-repetisjons verdier blir påvirket, betyr dette at de geometriske-spesifikke variablene s og i (tabell 1), som brukes til å bestemme antall VNTR gjentas, må kalibreres på nytt. Dette innebærer lineær regresjon på tomter sammenligne nøyaktig sekvens størrelser versus CE størrelse samtaler, som beskrevet av Gulla et al. 201814.
Split topper og stammer topper, både kjente gjenstander i CE basert MLVA skrive17, kan observeres i electropherograms under størrelsen ringer (Figur 4). Mens stammer topper bør ignoreres, bør den lengre toppen konsekvent velges for nedstrøms anvendelser i tilfelle av splittet topper adskilt av et enkelt base par. Dessuten, fraværende topper indikerer mangel på bestemte VNTR Loci er sjeldne, men kan oppstå, i så fall en gjentakelse antall ‘ 0 ‘ skal tildeles. Hvis start kulturen som DNA trekkes ut fra ikke er ren (dvs. inneholder mer enn én Y. ruckeri under type), kan flere høye topper som tilsvarer ulike alleler av samme geometriske/Loci OBSERVERES etter CE. Sekundær dyrket må deretter utføres fra enkelt kolonier før ny DNA-ekstraksjon for re-typing.
Som det fremgår av protokollen, bør mal DNA for PCR som standard trekkes ut fra rene kulturer av Y. ruckeri. I noen få tilfeller, imidlertid, egg-Fluid prøver tester positiv for Y. ruckeri av QPCR (CT-verdier < 27) ble vellykket MLVA skrevet direkte, uten tidligere dyrking, ved hjelp av en økt mengde genomisk DNA (ekstrahert med kommersielle Kit) som mal. Selv om denne tilnærmingen ikke har blitt grundig testet eller bekreftet, betyr det indikere potensialet i denne MLVA analysen for undersøkelse av komplekse biologiske matriser som inneholder DNA fra en rekke ulike organismer i tillegg til Y. ruckeri.
Hele MLVA skrive prosedyren presenteres her, fra DNA-ekstraksjon til epizootiological evaluering, kan være ferdig i en enkelt arbeidsdag. Imidlertid er antall prøver undersøkt i et sublinear forhold med tiden som kreves for DNA-ekstraksjon, PCR og CE, og metoden er derfor mye mer tid effektivt når du kjører flere prøver samtidig. Dette er likevel tilfelle for de fleste Lab-baserte metoder, og som et verktøy for epidemiologiske subtyping av Y. ruckeri, kombinasjonen av høy oppløsning, enkelhet og portabilitet gjør dette MLVA analysen overlegen tidligere publiserte protokoller4 ,5. Det har også blitt brukt til å verifisere begrenset epidemiologiske relevans av Y. ruckeri serotyping14.
Gjennom en omfattende MLVA basert befolknings studie som involverer 484 Y. ruckeri isolerer utvinnes fra en rekke spatiotemporal opprinnelse og habitater (vert fisk, miljø, osv.), vår forståelse om epizootiology og befolkning strukturen av denne viktige fisken patogen ble betydelig økt14. MLVA typing aktivert tracing av kloner spres anthropogenically over flere ti år, antagelig gjennom transport av fisk, samt identifisering av lokalt begrenset stammer. Videre, mens noen klonal komplekser av bakterien klart kunne knyttes til sykdom spesielt fiske verter (regnbueørret og atlantisk laks, henholdsvis), ble andre bare utvunnet fra miljømessige kilder og/eller klinisk upåvirket fisk Prøver. Anvendelsen av metoden er således ikke bare begrenset til infeksjon tracing, da det kan også gi informasjon om potensiell relevans f. eks for vaksine utvikling, risikovurdering, og vedlikehold av nasjonale biosikkerhet. Det er for tiden i aktiv bruk ved Veterinærinstituttet som et verktøy for å undersøke Y. ruckeri diagnoser i norsk akvakultur.
The authors have nothing to disclose.
Den nåværende studien ble finansiert av norsk sjømat Forskningsfond, FHF (prosjekt NOS. 901119 og 901505). Vi ønsker å takke alle bidragsytere av bakterielle isolerer og prøver brukt under metodeutvikling.
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |