El ensayo Multi-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis (MLVA) presentado aquí permite el genotipado económico, robusto y portátil de alta resolución de la bacteria patógena de peces Yersinia ruckeri. A partir de cultivos puros, el ensayo emplea PCR multiplex y electroforesis capilar para producir perfiles MLVA de diez loci para aplicaciones posteriores.
Yersinia ruckeri es un patógeno importante de los salmónidos cultivados en todo el mundo, pero faltan herramientas simples adecuadas para investigaciones epizootiológicas (localización de infecciones, etc.) de esta bacteria. Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de análisis de repetición en tándem (MLVA) de número variable de varios lóbulos como una herramienta de fácil acceso e inequívoca para el genotipado de alta resolución de aislados recuperados. Para el ensayo MLVA presentado aquí, el ADN se extrae de muestras de Y. ruckeri cultivadas hirviendo por células bacterianas hirviendo en agua, seguido por el uso de sobrenadante como plantilla para PCR. Los pares de imprimación dirigidos a diez loci de repetición en tándem de número variable (VNTR), intercalados a lo largo del genoma de Y. ruckeri, se distribuyen equitativamente entre dos reacciones de PCR de cinco plántulas que se ejecutan en condiciones de ciclo idénticas. Las imprimaciones delanteras están etiquetadas con cualquiera de los tres colorantes fluorescentes. Tras la confirmación de amplicon por electroforesis de gel, los productos de PCR se diluyen y se someten a electroforesis capilar. A partir de los perfiles de electroferograma resultantes, los picos que representan cada uno de los loci VNTR se llaman al tamaño y se emplean para calcular los recuentos de repetición de VNTR en silico. Los perfiles MLVA resultantes de diez dígitos se utilizan para generar árboles de expansión mínimos que permiten la evaluación epizootiológica mediante análisis de clústeres. Los datos de salida altamente portátiles, en forma de perfiles numéricos de MLVA, se pueden comparar rápidamente entre laboratorios y colocarse en un contexto espaciotemporal. Todo el procedimiento, desde la colonia cultivada hasta la evaluación epizootiológica, puede completarse hasta 48 aislados de Ruckeri en un solo día laborable.
Yersinia ruckeri, una bacteria Gram-negativa y miembro de la familia Yersiniaceae, causa yersiniosis en peces salmónidos cultivados en todo el mundo1. Se diagnostica fácilmente a partir de peces infectados por el cultivo en muchos tipos de medios de agar, pero hasta hace poco, poco se sabía sobre la estructura de la población y epizootiología de Y. ruckeri en todo el mundo y en diferentes hábitats (especies anfitrionas, etc.). Los sistemas de serotipado existentes para Y. ruckeri son inconsistentes, carecen de compatibilidad mutua y ofrecen una baja resolución epidemiológica. Se han realizado algunos estudios moleculares sobre la bacteria, empleando técnicas como la tipificación por secuencia multilocus (MLST), la electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE) o el análisis de secuencia de genoma completo (WGS)2,3,4 ,5. Sin embargo, MLST no proporciona una resolución suficientemente alta para el rastreo rutinario de infecciones, mientras que PFGE es exigente con mano de obra y produce resultados que no son fácilmente portátiles entre los laboratorios. Si bien el análisis del WGS proporcionaría una resolución casi definitiva, el establecimiento y la aplicación de esos análisis preestablecerían capacidades técnicas y bioinformáticas que, sin embargo, se limitarían a un número relativamente pequeño de laboratorios.
Multi-locus Análisis de repetición en tándem de número variable (MLVA) representa una herramienta de tipificación molecular simple y de fácil acceso, que ofrece una resolución genética en algunos casos casi igualada a la del análisis WGS6,7. La técnica se basa en la variación de números de repetición en loci seleccionados de repetición en tándem de número variable (VNTR), lo que resulta en datos de salida que son altamente transportables, haciendo la comparación de aislados perfilados hacia bases de datos en línea y a través de laboratorios sencillo. Aunque el MLST sigue siendo el estándar de oro para la tipificación epidemiológica de muchos patógenos bacterianos, un número creciente de estudios identifican una potencia discriminatoria significativamente mayor de MLVA8,9,10. También se han publicado varios protocolos dirigidos a bacterias patógenas de peces, como Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida y Renibacterium salmoninarum11,12, 13.
El protocolo MLVA de diez loci presentado aquí, que recientemente formó la base para un extenso estudio de población de Y. ruckeri 14,implica la extracción de ADN de colonias cultivadas en agar, PCR multiplex y electroforesis capilar (CE), seguido de las aplicaciones de silico aguas abajo. Para cada aislado examinado, dos PCR multiplex, ambos que contienen cinco pares de imprimación etiquetados fluorescentemente (6FAM, NED o VIC) cada una de las regiones VNTR individuales, se ejecutan en paralelo en condiciones idénticas. Tras la verificación de los amplicons de PCR por electroforesis de gel (GE), los productos de PCR se diluyen antes del análisis CE, y los picos que representan los respectivos loci de VNTR son llamados de tamaño a partir de los archivos de electroferograma resultantes. Junto con las fórmulas específicas del locus que que representan las discrepancias menores, específicas de la secuencia en los patrones migratorios CE, las llamadas del tamaño CE VNTR entonces se emplean para calcular los recuentos de repetición VNTR que se concatenan en los perfiles MLVA de diez dígitos. Estos se utilizan como entrada para evaluaciones epizootiológicas (por ejemplo, mediante análisis de clústeres en diagramas de árbol de expansión mínimo (MST).
Ambos PCR multiplex presentados aquí han aparecido relativamente robustos frente a la mala calidad del ADN de la plantilla, pero la falta de amplificación de PCR se observó sin embargo ocasionalmente cuando se utilizan plantillas con concentraciones de ADN extremadamente altas. Estos problemas se resolvieron fácilmente diluyendo las plantillas antes de la PCR. También se pueden utilizar otros métodos para la extracción de ADN distintos del que se emplea aquí (por ejemplo, kits comerciales).
Aunque se esperan cinco amplicons de cada reacción PCR multiplex, no siempre se deben esperar cinco bandas visualmente distinguibles de GE, ya que algunos loci VNTR (etiquetados de forma diferente) dentro de la misma reacción tienen rangos de tamaño superpuestos. El tiempo final de extensión de PCR de 60 min puede acortarse si es necesario, pero probablemente dará lugar a la mayor ocurrencia de picos divididos en los electroferogramas CE posteriores (ver más abajo). En particular, como el propósito del paso GE es puramente para la verificación cualitativa de los amplicons de PCR, el tiempo de ejecución, el voltaje y /o la receta de gel pueden ajustarse como se prefiera. Si GE observa bandas particularmente débiles, puede ser aconsejable reducir el factor de dilución de esas muestras antes de la CE.
Mientras que el protocolo CE descrito aquí se ejecutó en un aparato de electroforesis capilar comercial específico (ver Tabla de Materiales),diferentes sistemas CE pueden tener diferentes requisitos de muestra, lo que a su vez puede provocar algunas modificaciones en el protocolo . Consulte el manual del fabricante del sistema CE respectivo para obtener instrucciones sobre los reactivos/equipos apropiados, calibración, etc. para el análisis de fragmentos. También existe la posibilidad de que los patrones de movilidad de amplificación sesgados observados durante el CE puedan diferir, relativamente, entre los sistemas CE y/o las máquinas, como se ha documentado previamente para otros protocolos MLVA15,16. Si ocurre en una medida en la que los recuentos finales (redondeados) de repetición de VNTR se ven afectados, esto significa que las variables específicas del locus s e i (Tabla1), utilizadas para determinar los recuentos de repetición de VNTR, deben ser recalibradas. Esto implica la regresión lineal en las gráficas que comparan los tamaños de secuencia precisos con las llamadas de tamaño CE, como se describe en Gulla et al. 201814.
Los picos divididos y los picos de tartamudeo, ambos artefactos conocidos en la escritura17de MLVA basada en CE, se pueden observar en electroferogramas durante las llamadas de tamaño (Figura4). Mientras que los picos de tartamudeo deben ser ignorados, el pico más largo debe seleccionarse constantemente para las aplicaciones aguas abajo en el caso de picos divididos separados por un solo par base. Además, los picos ausentes que indican la falta de loci VNTR particulares son raros, pero pueden ocurrir, en cuyo caso se debe asignar un recuento repetido de ‘0’. Si el cultivo inicial del que se extrae el ADN no es puro (es decir, contiene más de un subtipo Y. ruckeri), se pueden observar varios picos altos correspondientes a diferentes alelos del mismo locus/loci después de la CE. Los cultivos secundarios deben realizarse desde colonias individuales antes de la nueva extracción de ADN para volver a escribir.
Como se indica en el protocolo, el ADN de la plantilla para PCR debe extraerse por defecto de los cultivos puros de Y. ruckeri. En algunos casos, sin embargo, las muestras de líquido de huevo según resultado de Y. ruckeri por qPCR (Ct-values < 27) se mecanografiaron con éxito MLVA directamente, sin cultivo previo, utilizando una mayor cantidad de ADN genómico (extraído con kit comercial) como plantilla. Aunque este enfoque no ha sido ampliamente probado ni verificado, sí indica el potencial de este ensayo MLVA para el examen de matrices biológicas complejas que contienen ADN de una gama de diferentes organismos además de Y. ruckeri.
Todo el procedimiento de mecanografía MLVA presentado aquí, desde la extracción de ADN hasta la evaluación epizootiológica, puede completarse en un solo día laborable. Sin embargo, el número de muestras examinadas está en una relación sublineal con el tiempo necesario para la extracción de ADN, PCR y CE, y por lo tanto el método es mucho más eficiente en el tiempo cuando se ejecutan varias muestras simultáneamente. Este es sin embargo el caso de la mayoría de los métodos basados en laboratorio, y como una herramienta para la subtipificación epidemiológica de Y. ruckeri, la combinación de alta resolución, simplicidad y portabilidad hace que este ensayo MLVA superior a los protocolos publicados anteriormente4 ,5. También se ha utilizado para verificar la relevancia epidemiológica limitada de Y. ruckeri serotipado14.
A través de un estudio integral de la población basado en MLVA que involucra 484 aislados de Y. ruckeri recuperados de una gama de orígenes y hábitats espaciotemporales (peces huésped, medio ambiente, etc.), nuestra comprensión con respecto a la epizootiología y la población estructura de este importante patógeno de peces se incrementó sustancialmente14. La mecanografía MLVA permitió el rastreo de clones diseminados antropogénicamente durante décadas, presumiblemente a través del transporte de peces, así como la identificación de cepas confinadas localmente. Además, si bien algunos complejos clonales de la bacteria podrían estar claramente asociados con enfermedades en particular de los huéspedes de peces (trucha arco iris y salmón del Atlántico, respectivamente), otros sólo se recuperaron de fuentes ambientales y/o peces clínicamente no afectados Especímenes. Por lo tanto, la aplicabilidad del método no sólo se limita al rastreo de la infección, ya que también puede proporcionar información de relevancia potencial, por ejemplo, para el desarrollo de vacunas, la evaluación del riesgo y el mantenimiento de la bioseguridad nacional. Actualmente está en uso activo en el Instituto Veterinario Noruego como herramienta para investigar los diagnósticos de Y. ruckeri en la acuicultura noruega.
The authors have nothing to disclose.
El presente estudio fue financiado por el Fondo Noruego de Investigación de Mariscos, FHF (proyecto nos. 901119 y 901505). Deseamos dar las gracias a todos los contribuyentes de aislados bacterianos y muestras utilizadas durante el desarrollo del método.
22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
Freezer | As preferred. | NA | |
Fume cupboard | As preferred. | NA | |
Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
Heating block | As preferred. | NA | |
Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
Vortexer | As preferred. | NA |