miRNA 치료제 암 진행을 조절에 상당한 잠재력이 있다. 여기 설명 분석 접근 사용 된다 세포 주기 및 신생 중단 조합 미르 치료의 활동의 식별을 위해.
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정오 공지
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요약
초록
폐 암 (LC)은 전세계 암 관련 된 죽음의 주요 원인입니다. 다른 암 세포와 마찬가지로, 액정 셀의 기본적인 특성은 관계가 없는 확산 및 세포 분열 이다. 억제 세포 주기 진행을 중단 하 여 확산의 LC를 포함 한 암 치료에 대 한 유망한 접근 되도록 표시 되었습니다.
miRNA 치료제 중요 한 post-transcriptional 유전자 레 귤 레이 터로 등장 하 고 암 치료에 사용 하기 위해 점점 공부 되 고 있다. 최근 작품에서 우리는 두 miRNAs, 143 미르와 미르-506, 세포 주기 진행 조절 하 활용. A549 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 세포 페 했다, 유전자 표현 변경 했다 분석 하 고 치료 때문에 apoptotic 활동 마지막으로 분석 했다. 종속 kinases (CDKs)의 Downregulation 감지 했다 (즉, CDK1, CDK4 그리고 CDK6), 세포 주기 G1/G2/M 및 상전이에 중단 하 고. 경로 분석 다각적인 활동 접근을 endows 치료의 잠재적인 항 혈관 신생 활동을 가리킨다. 여기, 설명 된 혈관 신생의 억제에 의해 세포 주기 억제, apoptosis의 유도 및 내 피 세포에 치료의 효과 관한 miRNA 활동을 식별 하기 위해 사용 하는 방법론입니다. 그것은 여기에 제시 된 방법 미르 치료제와 해당 활동에 미래 연구를 지원 합니다 및 대표적인 데이터 실험 분석 하는 동안 다른 연구자를 안내할 것입니다 기대.
서론
세포 주기 mitotic 프로세스1를 통해 DNA와 세포 확산의 중복을 허용 하는 여러 규제 이벤트의 조합 이다. 종속 kinases (CDKs)을 조절 하 고 세포 주기2를 홍보 합니다. 그 중, mitotic CDK (CDK1) 및 interphase CDKs (CDK2, CDK4, 및 CDK6)에 있는 중추적인 역할 세포 주기 진행3. Retinoblastoma 단백질 (Rb)는 CDK4/CDK6 복잡 한 세포 주기 진행4, 허용에 의해 phosphorylated 그리고 CDK1 활성화5성공적인 세포 분열 위해 필수적 이다. 수많은 CDK 억제제를 개발 하 고 지난 몇 년간 CDKs 암 치료에서 표적으로 하기의 가능성을 나타내는 임상 시험에서 평가 되었습니다. 사실, 3 CDK 억제제 유방암의 치료에 대 한 승인 되었습니다 최근6,7,8,,
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프로토콜
1. 미르-143 및 미르-506 transfection
주의: 라텍스 장갑, 보호 안경, 그리고 실험실 외 투를 사용 하 여 설명된 실험을 수행 하는 동안. 필요한 경우 biosafety 내각을 사용 하 여 캐비닛 팬에, 기도 차단 또는 판 상 공기 흐름을 방해 하지 않고. 항상 제조 업체에 의해 설명 된 대로 적절 한 높이에 보호 유리 창을 설정 합니다.
- T25 cm2 플라스 크/6/96 잘 접시 DMEM/F12K 미디어에서 씨 NSCLC A549 세포 10 %FBS 1% 페니실린-스 (문화 미디어) 조직 문화 후드에서 보충 하 고 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 미르-143 / 미르-506 모방, 일시 중단 또는 transfecting 에이전트와 siRNA를 출 격 (미르의 2.4 µ g 14 µ L transfecting 에이전트의 혼합 했다; 테이블의 자료를 참조) transfection 미디어와 1.5 mL 혈 청의와 항생제 무료 500 µ L에서 DMEM/F12K 미디어에는 마지막 미르 농도 100의 nM. 미르 금액 다른 셀 및 농도에 최적화를 해야 합니다. 적절 한 접근에는 미르 (즉, ....
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결과
실시간 정량 Pcr 및 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 유전자 표정 분석
실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 차동 유전자 표정 분석 대상된 유전자 CDK1, CDK4, 및 CDK6의 상당한 downregulation 시연. CDK1 및 CDK4/6 될 G2/M과 g 1/S 전환에 대 한 각각을 표시 했다. 수행된 분석 개별 미르와 미르 조합 활동 사이 직접적인 비교를 허용. 평가 절차에서 어떠한 간섭의 허용 transfecting 에이전트와 함께 출 격 siRNA 사용 하 여 감지 유전자 downregulation를 최소화 했다. 데이터는 양측 스튜던트 t를 사용 하 여 분석 통계 되었다-테스트, 그리고p < 0.05 통계적 (그림 1)으로 간주.......
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토론
miRNAs의 식 수준 dysregulation를 인식 하는 암 치료에 대 한 표적으로 한 치료로 서 작동할 수 정상 조직의 대 병. 이 연구 목적 miRNAs 잠재적으로 여러 단계 세포 주기 진행 중단을 결정. 그것은 143 미르와 미르-506 암 세포, 그리고이 조합 미르 치료의 활동을 이해 하는 목적으로 제시 프로토콜의 세포 주기 정지 확인 되었다.
설명된 방법론 miRNAs의 기능에 지배적인 이해를 제공합니다. 공부 하는 miRNAs의도 전에 그들의 능력을 여러 개의 유전자를 대상으로 하 고 따라서 여러 경로 영향을 미칠와 연결 됩니다. 설명된 정량 분석 구체적인 목표는 치료 전에 식별 하는 경우 관심의 특정 유전자의 표정의 식별 수 있습니다. 예를 들어 여기에 주요 초점 CDK1 및 CDK4/6과 세포 주기의 표현 이었다.
따라서, 세포 주기 분석 propidium 요오드 화물 및 흐름 cytometry 프로토콜을 사용 .......
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공개 사항
저자는 RNA 시퀀싱 데이터 그리고 텍사스 대학 남서 의료 센터, 맥 더 못에 대 한 센터 다음 세대 시퀀싱 코어의 경로 분석에 대 한 그의 도움에 대 한 존 Caskey 루이지애나 주립 대학에서 인정 하 고 싶습니다. RNA 시퀀싱 데이터 분석을 수행. 이 연구는 약 학 대학, 대학교의 루이지애나 몬로 시작, 자금과 국립 보건원 (NIH) 국립 연구소의 종합 의료 과학 보조금 5 P20 GM103424-15, 3 P20 GM103424-15S1 통해 의해 지원 되었다.
감사의 글
관심 없음 충돌 선언 됩니다.
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재료
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| 96-웰 마이크로웰 플레이트 | Thermo Scientific | 12-556-008 | |
| A549 비소세포폐암 세포 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| 아가로스 | VWR | 0710-25G | |
| 애질런트 2100 바이오분석기 | 애질런트 테크놀로지 | G2938c | |
| 앰비온 소음기 음성 제어 번호 1 siRNA | 앰비온 | AM4611 | |
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참고문헌
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- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Malumbres, M., Barbacid, M.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis
