אסטרטגיה מתכנס לדור של ספריית דנ א בלתי מופנה מצדפות פסיפיק
Summary
אנו מתארים אסטרטגיה כיצד להשתמש בדגימות RNA מתוך דגימות הצדפה הפסיפיק, ולהעריך את החומר הגנטי על ידי השוואה עם נתוני הגנום זמין בפומבי כדי ליצור ספריית cDNA כמעט רציף.
Abstract
הגישה לחומר ביולוגי של מינים התייחסות, אשר שימשו בעבר ניסויים מרכזיים כגון בפיתוח של קווי התא הרומן או פרויקטים ברצף הגנום, הם לעתים קרובות קשה לספק למחקרים נוספים או צדדים שלישיים בשל ה consumptive הטבע של הדגימות. למרות שעכשיו נרחב מופץ על חופי האוקיאנוס השקט של אסיה, אוסטרליה וצפון אמריקה, בודדים האוקיינוס השקט דגימות מגוונות מבחינה גנטית ולכן הם לא מתאימים ישירות כמו חומר מתחיל עבור ספריות גנים. במאמר זה, אנו מדגימים את השימוש בדגימות של צדפות האוקיינוס השקט שהתקבלו משוקי פירות ים אזוריים כדי ליצור ספריות cDNA. ספריות אלו הושוו לגנום הצדפות הזמין בציבור, והספרייה הקרובה ביותר נבחרה באמצעות התייחסות מיטוכונדריאלי גנים ציטוכרום C אוקסידאז I (COX1) ו-NADH דהידרוגנאז (ND). ההתאמה של הספרייה cdna שנוצר מומחש גם על ידי שיבוט וביטוי של שני גנים קידוד האנזימים של החומצה udp גלוקוראז (אויח) ו-udp-xylose אבד סטנדרטים (uxs), אשר אחראים על הביוסינתזה של udp-קסיפסיד מ UDP-גלוקוז.
Introduction
הקניית החומר הביולוגי שניתן לטפל בהן, עלולה להיות מאתגרת עקב זמני משלוחים ארוכים, הסקת מסקנות יזמות או תקנות מכס ספציפיות למדינה. כחלופה, החומר הביולוגי הנדרש ניתן גם לאיסוף מדגימות זהות בדרך כלל. עם זאת, דוגמאות אלה עשויות להשתנות באופן משמעותי ברמת ה-גנוטיפ, ולכן השוואות בעלות התייחסות דיגיטלית מאוחסנת מאותו מינים מעובדים לעתים קרובות קשות או אפילו חסרות תועלת עקב אי התאמה של החומר החדש ממקור עם שיטות הגברה קיימות של הדנ א. רצף הגנים שנשמרים במיוחד של דגימות בודדות הוא כלי נפוץ ורב עוצמה לזיהוי מינים1, כגון גנים מיטוכונדריאלי שימור המשמשים לעתים קרובות גנים התייחסות להערכת איכות של ספריות cdna2 ,3,4,5,6 הרציונל הבסיסי של שיטה זו הציגה הוא כי שימור גבוה של רצפי גנים מיטוכונדריאלי בדגימות הצדפה אנונימי בודדים לעומת רצפים המקביל של הגנום התייחסות מעיד כי גנים אחרים עשויים גם להראות רמה נמוכה של סטייה, בהינתן שיעור מהיר בדרך כלל של האבולוציה מיטוכונדריאלי ביחס ל-DNA גרעיני7, המאפשר הגברה ובידוד של מגוון רחב של גנים רלוונטיים מדעית ותעשייתית על ידי שימוש בפומבי נתוני רצף נתונים זמינים כהפניה.
המטרה הכוללת של השיטה המתוארת היא להציג זרימת עבודה ממוטבת ליצירת הצדפה כמעט רציף cDNA הספרייה אשר ניתן להשתמש בה כמו DNA תבנית עבור שיבוט של גנים צדפה. ברצף וירטואלי, רצף הגנום דה נובו הוא שפרקו; במקום זאת, משתמשים ברצף הפניה מוכר ומאוחסן באופן דיגיטלי כדי לנצל או לעצב צבעי יסוד לייצור cDNAs שבסופו של דבר מהווים ספריה (או יתווספו לקיים מראש). המטרה היא לייצר ספריית cDNA מתכנסת, כלומר דמיון בין רצפי ה-Dna שנוצרו ואת רצף ההתייחסות יכול להיות מדורגת מפני התפצלות נמוך עד גבוה. יתרון מרכזי של שימוש בציטוכרום C אוקסידאז משנה 1 (COX1) ו NADH Dehydrogenase (ND) כמו גנים התייחסות היא כי אפילו מאוד גיאוגרפית ופרד דגימות הצדפות ניתן לפרופיל בשל שימור גבוה של גנים אלה מיטוכונדריאלי. לאחר הוכיחה את הגישה עם סמנים אלה מבוססים, אנו לאחר מכן להדגים את היישום שלה לשני מועמדים אנזימים אשר מעורבים בביוסינתזה נוקלאוטיד סוכר ועשויים להיות בעלי רלוונטיות תעשייתית8,9, 10. הפוטנציאל הביוטכנולוגי של הצדפה באוקיינוס השקט עדיין לא נחקר. לפיכך, אנו מאמינים כי שיטה מתכנס זו להכנת ספריית cDNA כמעט ברצף יהיה גם מתאים לחוקרים שאינם מומחים המעוניינים ליצור cDNA מחומר זה ביולוגי רלוונטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג מאפשר זיהוי גנטי של דגימות צדפה ללא הפניה עם פנוטיפ דומה משוקי פירות ים אזוריים על ידי השוואה של הגנים COX1 ו-ND עם מאגר הגנום ה-DNA צדפה זמין בפומבי. המשמעות של שיטה זו טמונה בפשטותו, כמו רק תגובת PCR אחת נדרשת להערכת הספרייה cDNA וירטואלי. שני COX1 מיטוכונדריאלי שמרו וגנים ND הוהוגדל ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת בחלקו של הקרן המדע הטבעי של סין (להעניק מספרים 31471703, A0201300537 ו 31671854 ל J.V. ו זמנהוף, גרנט מספר 31470435 G.Y.), ואת תוכנית כשרונות זרים 100 (מענק מספר JSB2014012 ל J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
- Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
- Wen, J., et al. Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market. Food Control. 90, 199-204 (2018).
- Zhang, H., et al. Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).
- Sell, J., Spirkovski, Z. Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation. Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).
- Karadjian, G., et al. Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).
- Morga, B., et al. Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR. Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).
- Delsuc, F., et al. Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes. Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).
- Wei, S., et al. Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila. Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).
- Gu, B., et al. Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus. Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).
- Duan, X. C., et al. Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- Song, H. B., et al. UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).
- Gainey, P. A., Phelps, C. F. Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans. Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).
