Конвергентная стратегия для поколения практически секвенированных cDNA библиотека от неупомянутых тихоокеанских устриц
Summary
Мы описываем стратегию использования образцов РНК из неупомянутых образцов тихоокеанских устриц и оцениваем генетический материал по сравнению с общедоступными данными генома для создания практически секвенируемой библиотеки кДНК.
Abstract
Доступ к биологическому материалу эталонных видов, которые ранее использовались в ключевых экспериментах, таких как разработка новых клеточных линий или проектов секвенирования генома, часто трудно предусмотреть для дальнейших исследований или третьих сторон из-за расходный характер образцов. Хотя в настоящее время широко распространены на тихоокеанском побережье Азии, Австралии и Северной Америки, отдельные образцы тихоокеанских устриц генетически довольно разнообразны и поэтому не подходят непосредственно в качестве исходного материала для библиотек генов. В этой статье мы демонстрируем использование неупомянутых тихоокеанских устриц, полученных на региональных рынках морепродуктов для создания библиотек кДНК. Затем эти библиотеки были сравнены с общедоступным геномом устриц, и ближайшая соответствующая библиотека была выбрана с использованием митохондриальных эталонных генов Cytochrome C Oxidase subunit I (COX1) и NADH Dehydrogenase (ND). Пригодность генерируемой библиотеки кДНК также демонстрируется путем клонирования и экспрессии двух генов, кодирующих ферменты UDP-глюкуроновая кислота дегидрогеназы (UGD) и udP-xylose synthase (UXS), которые отвечают за биосинтез UDP-xylose от УДП-глюкоза.
Introduction
Приобретение живого эталонного биологического материала может быть сложным из-за длительного срока поставки, предпринимательских рассуждений или таможенных правил, касающихся конкретных стран. В качестве альтернативы необходимый биологический материал может быть также собран из фенотипически идентичных образцов. Однако эти образцы могут значительно различаться на уровне генотипа, и поэтому сравнения с цифровыми эталонными геномами одного и того же вида часто оказываются трудными или даже бесполезными из-за несовместимости вновь полученного материала с существующих методов усиления ДНК. Секвенирование высоко сохранимых генов отдельных образцов являетсяшироко используемым и мощным инструментом для идентификации видов 1, таких как сохраненные митохондриальные гены, которые часто используются в качестве эталонных генов для оценки качества библиотек кДНК2 ,3,4,5,6. Основное обоснование представленного метода заключается в том, что высокая сохранность последовательностей митохондриальных генов в отдельных анонимных образцах устриц по сравнению с соответствующими последовательностями эталонного генома указывает на то, что другие гены могут также показывать низкий уровень дивергенции, учитывая в целом более высокуюскорость эволюции митохондриальной ДНК по отношению к ядерной ДНК 7, что позволяет усиление и изоляцию широкого спектра научно и промышленно значимых генов, просто используя публично доступные данные последовательности в качестве эталона.
Общая цель описанного в настоящем методе состоит в том, чтобы представить оптимизированный рабочий процесс для создания практически секвенированной библиотеки кДНК устрицы, которая может быть использована в качестве шаблона ДНК для клонирования генов устриц. При виртуальном секвенировании секвенирования генома de novo обходится; вместо этого, известная, цифрово-сохраненная справочная последовательность используется непосредственно для использования или разработки праймеров для производства cDNA, которые в конечном итоге будут состоять из библиотеки (или будут добавлены к уже существующей последовательной). Цель состоит в том, чтобы создать конвергентную библиотеку кДНК, что означает, что сходство между сгенерированными последовательностями кДНК и эталонной последовательностью может ранжироваться от низкого к высокому расхождению. Ключевым преимуществом использования Cytochrome C Oxidase subunit 1 (COX1) и NADH Dehydrogenase (ND) в качестве эталонных генов является то, что даже высоко географически разъединяющие образцы устриц могут быть профилированы из-за высокой консервации этих митохондриальных генов. Доказав подход с этими устоявшимися маркерами, мы затем демонстрируем его применение к двум ферментнымкандидатам, которые участвуют в биосинтезе нуклеотида сахара и могут иметь промышленное значение 8,9, 10. Биотехнологический потенциал тихоокеанской устрицы до сих пор не изучен. Таким образом, мы считаем, что этот сходящийся метод для подготовки практически секвенированных библиотеки кДНК также будет подходящим для неспециалистов исследователей, которые хотят генерировать кДНК из этого соответствующего биологического материала.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол позволяет генетическую идентификацию неупомянутых образцов устриц с аналогичным фенотипом региональных рынков морепродуктов путем сравнения генов COX1 и ND с общедоступной базой данных генома ДНК устриц. Значение этого метода заключается в его простоте, так ка?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук Китая (грант ы 31471703, A0201300537 и 31671854 до J.V. и L.L., грант номер 31470435 для G.Y.), и 100 иностранных талантов плана (грант номер JSB2014012 до J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
- Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
- Wen, J., et al. Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market. Food Control. 90, 199-204 (2018).
- Zhang, H., et al. Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).
- Sell, J., Spirkovski, Z. Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation. Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).
- Karadjian, G., et al. Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).
- Morga, B., et al. Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR. Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).
- Delsuc, F., et al. Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes. Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).
- Wei, S., et al. Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila. Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).
- Gu, B., et al. Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus. Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).
- Duan, X. C., et al. Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- Song, H. B., et al. UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).
- Gainey, P. A., Phelps, C. F. Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans. Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).
