En sammenfallende strategi for generering av en nesten sekvensielt cDNA bibliotek fra ubrukte Pacific østers
Summary
Vi beskriver en strategi for hvordan du bruker RNA prøver fra ubrukte Pacific østers prøver, og evaluere genetisk materiale ved sammenligning med offentlig tilgjengelige Genova data for å generere et tilnærmet sekvensielt cDNA bibliotek.
Abstract
Tilgangen til biologisk materiale av referanse arter, som ble brukt tidligere i viktige eksperimenter som i utviklingen av romanen cellelinjer eller Genova sekvensering prosjekter, er ofte vanskelig å sørge for videre studier eller tredjeparter på grunn av consumptive natur. Selv nå vidt distribuert over Stillehavet kysten av Asia, Australia og Nord-Amerika, individuelle Stillehavet østers prøver er genetisk ganske mangfoldig, og er derfor ikke direkte egnet som utgangspunkt materiale for gen biblioteker. I denne artikkelen viser vi bruken av ubrukte Pacific østers prøver Hentet fra regionale sjømatmarkeder å generere cDNA biblioteker. Disse bibliotekene ble deretter sammenlignet med offentlig tilgjengelige østers Genova, og den nærmeste relaterte biblioteket ble valgt ved hjelp av mitokondrie referanse gener Cytokrom C oksidase delenhet I (COX1) og NADH dehydrogenase (ND). Egnetheten av den genererte cDNA biblioteket er også demonstrert ved kloning og uttrykk for to gener koding av enzymer UDP-glucuronic acid dehydrogenase (UGD) og UDP-xylose syntase (UXS), som er ansvarlig for biosyntesen av UDP-xylose fra UDP-glukose.
Introduction
Oppkjøpet av levende refererte biologisk materiale kan være utfordrende på grunn av lange leveringstider, entreprenør resonnement, eller landsspesifikke tollregler. Som et alternativ kan det nødvendige biologiske materialet også samles inn fra phenotypically identiske prøver. Imidlertid kan disse prøvene variere betydelig på nivået av genotype, og derfor sammenligninger med digitalt lagrede referanse genomer av samme art er ofte gjengitt vanskelig eller fåfengt på grunn av inkompatibilitet av den nylig Hentet materiale med eksisterende metoder for DNA-forsterkning. Sekvensering svært bevarte gener av individuelle prøver er en mye brukt og kraftig verktøy for å identifisere arter1, for eksempel bevarte mitokondrie gener som ofte brukes som referanse gener for kvalitetsvurdering av cDNA biblioteker2 ,3,4,5,6. Den underliggende begrunnelsen for heri presentert metoden er at høy bevaring av mitokondrie gen sekvenser i enkelte anonyme østers prøver i forhold til tilsvarende sekvenser av referansen Genova indikerer at andre gener kan også vise en lavt nivå av avvik, gitt den generelt raskere rate av mitokondrie DNA evolusjon i forhold til kjernefysisk DNA7, slik at forsterkning og isolering av et bredt spekter av vitenskapelig og industrielt relevante gener ved å bruke offentlig tilgjengelige sekvensering-data som en referanse.
Det overordnede målet for det her er beskrevet metoden er å presentere en optimalisert arbeidsflyt for å generere en tilnærmet sekvensert østers cDNA bibliotek som kan brukes som mal DNA for kloning av østers gener. I virtuelle sekvensering, de Novo Genova sekvensering er omgås; stedet, en kjent, digitalt lagret referanse sekvens brukes direkte til å utnytte eller design primere for produksjon av cDNAs som til slutt vil utgjøre et bibliotek (eller legges til en eksisterende en). Målet er å produsere et konvergent cDNA-bibliotek, som betyr at likheter mellom de genererte cDNA-sekvensene og referanse sekvensen kan rangeres fra lav til høy avvik. En viktig fordel ved å bruke Cytokrom C oksidase delenhet 1 (COX1) og NADH dehydrogenase (ND) som referanse gener er at selv svært geografisk endemisk østers prøver kan bli profilert på grunn av den høye bevaring av disse mitokondrie gener. Etter å ha bevist tilnærming med disse veletablerte markører, vi da demonstrere sin søknad til to enzym kandidater som er involvert i sukker nukleotid biosyntesen og kan være av industriell relevans8,9, 10. The bioteknologisk potensialet i Stillehavet østers er fortsatt uutforsket. Derfor tror vi at dette sammenfallende metode for å utarbeide et tilnærmet sekvensielt cDNA biblioteket vil også være hensiktsmessig for ikke-spesialiserte forskere som ønsker å generere cDNA fra denne relevante biologiske materialet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det forevist protokollen innrømmer det genetisk legitimasjonen av ubrukte østers prøver med lignende fenotype fra område Seafood marked av sammenligningen av det COX1 og ND gener med en offentlig anvendelig østers DNA Genova data bank. Betydningen av denne metoden ligger i sin enkelhet, som bare en enkelt PCR reaksjon er nødvendig for evalueringen av den virtuelle cDNA biblioteket. De to bevarte mitokondrie COX1 og ND gener ble forsterket fra en cDNA bibliotek som ble generert av omvendt transkripsjon av RNA ekstra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet delvis av Natural Science Foundation i Kina (gi tall 31471703, A0201300537 og 31671854 til J.V. og ll, gi nummer 31470435 til G.Y.), og den 100 Foreign talenter plan (Grant nummer JSB2014012 til J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| 1% Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | *Alternative distributors possible |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Alfa Aesar | 490-79-9 | *Alternative distributors possible |
| Acetonitrile | Merck | 75-05-8 | *Alternative distributors possible |
| Agarose for molecular biology | Biowest Chemicals | 111860 | *Alternative distributors possible |
| Ampicilin | Solarbio | 69-52-3 | *Alternative distributors possible |
| Chloroform | Lingfeng, Shanghai | 67-66-3 | *Alternative distributors possible |
| DEPC water | Thermo Scientific | R0601 | |
| Ethanol | Jinhuada, Guangzhou | 64-17-5 | *Alternative distributors possible |
| Guanidinium thiocyanate-phenol reagent | Invitrogen | 15596018 | TRIzol reagent |
| Imidazole | Energy Chemical | 288-32-4 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl alcohol | Nanjing Chemical Reagent | 67-63-0 | *Alternative distributors possible |
| Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside | Solarbio | 367-93-1 | *Alternative distributors possible |
| Kanamycin | Solarbio | 25389-94-0 | *Alternative distributors possible |
| LB Agar | Thermo Fisher | 22700025 | *Alternative distributors possible |
| LB Broth | Thermo Fisher | 10855021 | *Alternative distributors possible |
| Methanol | Jinhuada, Guangzhou | 67-56-1 | *Alternative distributors possible |
| MgCl2 hexahydrate | Xilong Huagong | 7791-18-6 | *Alternative distributors possible |
| NaCl | Xilong Huagong | 7647-14-5 | *Alternative distributors possible |
| NAD+ | Duly Biotech | 53-84-9 | *Alternative distributors possible |
| Phenyl-methylsulfonyl fluoride | Macklin | 329-98-6 | *Alternative distributors possible |
| Tris | Solarbio | 77-86-1 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucose | Wuhu Nuowei Chemicals | 28053-08-9 | *Alternative distributors possible |
| UDP-glucuronic acid | SIGMA | 63700-19-6 | *Alternative distributors possible |
| Tools/Instruments: | |||
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | *Alternative distributors possible |
| Metal block heater | Long Yang Scientific Instruments | Thermoshaker HB20 | *Alternative distributors possible |
| PCR thermocycler | Hema | 9600 | *Alternative distributors possible |
| Enzyme and Kits: | |||
| 10×Ligation buffer | Thermo Scientific | B69 | *Alternative distributors possible |
| 5×PrimeSTAR buffer | Takara | 9158A | |
| Alkaline phosphatase | ThermoFisher FastAP | EF0654 | *Alternative distributors possible |
| COX forward primer | Genscript | ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG | |
| COX reverse primer | Genscript | ACTTGACCAAAAACATAAGACATG | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B7204S | *Alternative distributors possible |
| dNTP mix | Invitrogen | 18427088 | |
| MgUGD forward primer | Genscript | ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT | |
| MgUGD reverse primer | Genscript | ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG | |
| MgUXS forward primer | Genscript | CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC | |
| MgUXS reverse primer | Genscript | ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT | |
| ND forward primer | Genscript | ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT | |
| ND reverse primer | Genscript | ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC | |
| PCR Cleanup Kit | AxyGen | AP-PCR-250 | *Alternative distributors possible |
| pET-30a(+) vector | Merck Millipore | 69909 |
References
- Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
- Wen, J., et al. Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market. Food Control. 90, 199-204 (2018).
- Zhang, H., et al. Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis. Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).
- Sell, J., Spirkovski, Z. Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation. Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).
- Karadjian, G., et al. Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).
- Morga, B., et al. Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR. Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).
- Delsuc, F., et al. Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes. Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).
- Wei, S., et al. Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila. Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).
- Gu, B., et al. Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus. Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).
- Duan, X. C., et al. Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- Song, H. B., et al. UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600 (2018).
- Gainey, P. A., Phelps, C. F. Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans. Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).
